Hur metylenblått tar sig in i celler: reduktion, återoxidation och membranfördelning

Om du ser en skål med endotelceller ta upp metylenblått är den uppenbara tolkningen också den felaktiga. Mediet förlorar sin blå färg och cellerna får blå granula, så färgämnet måste ha passerat membranet som den blå molekylen. Experimenten visar något annat. Den blå formen passerar knappt. Det som passerar är den färglösa formen, och det blå du ser inuti bildas där, efter att färgämnet kommit in.

Det omvända förloppet är viktigt eftersom det avgör vad färgningen kan och inte kan säga dig. Blå granula visar oxiderat färgämne som har återoxiderats och hållits kvar i organeller. De visar inte den totala mängden färgämne i cellen, de visar inte den reducerade poolen och de mäter inte biologisk effekt. För att förstå varför behöver vi följa de tre stegen: reduktion vid ytan, diffusion av den reducerade formen samt återoxidation och kvarhållning inuti.

De två formerna beter sig som olika molekyler

Oxiderat metylenblått är ett plant, positivt laddat ringsystem. Det löser sig i vatten, absorberar ljus starkt kring 600 till 700 nanometer och ser blått ut. Laddningen är avgörande. En laddad, vattenälskande molekyl passerar inte lätt genom ett lipidmembran, så den försiktiga formuleringen i litteraturen är relativt membranimpermeabel, inte impermeabel.

Reducerat metylenblått, som kallas leukometylenblått, är färglöst, oladdat och fettlösligt. Ta bort laddningen, så slutar membranet att fungera som en vägg. Den reducerade molekylen diffunderar lätt igenom, och när den väl befinner sig i ett mer oxiderande kompartment kan den åter avge elektroner och återgå till den blå, laddade form som hålls kvar. Färgämnets redoxkemi är därför också dess transportmekanism. Ändrar du antalet elektroner ändrar du permeabiliteten.

Elektronerna för det första steget kommer från cellen själv. Däggdjursceller bedriver elektrontransport över plasmamembranet och för över reducerande ekvivalenter från intracellulära donatorer till acceptorer vid ytan. Denna aktivitet över plasmamembranet är en normal cellfunktion som finns i de flesta celltyper. Reduktaset på endotelytan som hanterar tiazinfärgämnen beter sig som andra reduktaser i ett belysande avseende: det fortsätter att arbeta i närvaro av cyanid och azid vid doser som stoppar de senare stegen. Den skillnaden är nyckeln till hela förloppet.

Fördelningsmodellen kom först och förklarade nästan upptaget

År 1929 ställde Marian Irwin vid Rockefeller Institute en enklare fråga. Kanske handlar färgämnets inträde bara om fördelning mellan vatten och cellens fettrika skikt, och ett kloroformskikt kan representera dessa fettrika skikt i laboratoriet. I sina spektrofotometriska penetrationsstudier skakade hon vattenlösningar av färgämnen med kloroform och jämförde det som övergick till den organiska fasen med det som tog sig in i levande algceller.

Två fynd från det arbetet förtjänar fortfarande uppmärksamhet. För det första innehöll kommersiella metylenblåttlösningar trimetylt jonin, som numera kallas azure B, och denna förorening trängde in snabbare än metylenblått självt, särskilt vid alkaliskt pH där den lipidlösliga fria basformen dominerar. En del av det skenbara upptaget av metylenblått var i själva verket ett selektivt upptag av azure B. För det andra avgjorde pH utfallet genom att bestämma joniseringstillståndet, och skadade celler släppte in betydligt mer färgämne än intakta celler. Fördelningskoefficienter och laddningstillstånd styrde vad det konstgjorda systemet respektive den levande cellen tog upp, och likheten mellan dem stödde tanken på icke-vattenbaserade skikt i cellgränsen.

Modellen var framsynt när det gällde lipider och jonisering, men den kunde inte skilja mellan ett färgämne som fördelar sig i sin ursprungliga form och ett färgämne som omvandlas kemiskt vid ytan, passerar i en annan form och omvandlas tillbaka inuti. För den åtskillnaden krävdes ett annat experiment, som kom sjuttio år senare i lungendotel.

Reduktion utanför, kvarhållning inuti

Merker och kollegor arbetade med odlade endotelceller från lungartärer hos nötkreatur och föreslog ett förlopp i tre steg: det oxiderade färgämnet reduceras på cellytan till sin färglösa, lipofila form, den reducerade formen diffunderar in och intracellulär återoxidation återskapar den membranimpermeabla oxiderade formen, som ansamlas. I sin studie av endotelcellers upptag av tiazinfärgämnen prövade de sedan förloppet genom att försöka bryta det på specifika ställen.

Det första verktyget var ferricyanid, en elektronacceptor som inte kan ta sig in i cellen. När ytenzymer reducerar blått färgämne till dess färglösa form utanför cellen kan ferricyanid ta tillbaka elektronerna och återskapa blått färgämne i mediet innan det hinner passera membranet. Så länge ferricyanid fanns i överskott (10 mikromolar färgämne mot 50 till 500 mikromolar ferricyanid) upphörde färgämnesupptaget nästan helt. Först när ferricyaniden hade förbrukats återupptogs upptaget med normal hastighet. Kinetiken visade samma sak på ett annat sätt. Ferricyanid försvann med ungefär konstant hastighet, vilket stämmer med ett jämnt reduktionsflöde vid ytan som tillför elektroner till en mediator som kan återanvändas, medan det extracellulära färgämnet försvann exponentiellt när dess pool tömdes. Ett konstant flöde tillsammans med en pool som töms innebär att ferricyanidsignalen visar kontinuerlig reduktion, inte färgämnesmolekyler som lämnar lösningen.

Det andra verktyget tog helt bort passagesteget. Gruppen kopplade toluidinblått O, ett närbesläktat tiazinfärgämne, till en stor polyakrylamidkedja som var för stor för att ta sig in i cellen i något av oxidationstillstånden. Cellerna reducerade ändå det bundna färgämnet. Reduktion kräver alltså inget tillträde till cellens inre. Maskineriet är exponerat vid ytan eller elektriskt kopplat till den.

Sedan kom den åtskillnad som ger artikeln dess titel. Cyanid och azid vid 2 millimolar hämmade kraftigt ansamlingen av färgämne, och i mikroskopet försvann nästan helt de mörkblå och lila inneslutningar som normalt omger kärnan. Ändå bromsade ingen av hämmarna den extracellulära reduktionen: ferricyanidens kretslopp fortsatte oförminskat och den icke-permeabla polymeren reducerades fortfarande. Blockeringen låg längre fram i förloppet. Cyanid och azid stoppade intracellulär återoxidation och kvarhållning, inte reduktionen vid ytan. Kontroller av cellernas livskraft stödde tolkningen, eftersom cellerna behöll sitt cytosoliska markörenzym laktatdehydrogenas under dessa behandlingar. Det minskade upptaget berodde alltså inte bara på förgiftning eller bristningar i membranet.

En reservation från artikeln gäller fortfarande. De blå inneslutningarna låg runt kärnan men inte i den, vilket är förenligt med oxidation i subcellulära organeller, men studien identifierade inte vilka organeller det rörde sig om. Liknande mönster i andra celltyper hade kallats lysosomala på svagt underlag. Betrakta kvarhållningen som fastställd och lokaliseringen som preliminär. Den som följer vart elektronerna går härnäst kan läsa vidare om mitokondriell elektrontransport och redoxhantering och den bredare bilden av absorption och fördelning efter tillförselväg.

Färgning är inte exponering

En tredje studie visar vad som händer när denna upptagsmekanism kopplas till ett biologiskt mätvärde. Scott och kollegor fann att metyl-beta-cyklodextrin, en ringformad sockermolekyl, binder metylenblått direkt, med en associationskonstant på omkring 310 per molar för inklusionskomplexet jämfört med cirka 5846 per molar för färgämnets dimerisering. I L929-fibroblaster blockerade denna bindning både cellfärgning och stimuleringen av glukosupptag: förinkubation med cyklodextrinet förhindrade blåfärgning, och tillsats efteråt påskyndade avfärgningen. När den optiska blå signalen försvann från cellerna avtog den aktiverade glukostransporten i nära parallell.

Författarna tolkade denna korrelation som stöd för en direkt interaktion mellan färgämnet och ett protein i den signalväg som aktiverar glukostransportören, snarare än en långvarig mekanism med oxidativ stress. Den slutsatsen är rimlig men har sina begränsningar. Experimentet identifierar inte proteinet, visar inte bindning till själva transportören, och korrelationen mellan avfärgning och förlust av effekt kan inte utesluta alla redoxmedierade vägar.

Den bestående lärdomen handlar om mätning. Optisk färgning visar synligt, oxiderat, cellassocierat färgämne. Den missar helt den färglösa, reducerade poolen, så en svagt färgad cell kan fortfarande innehålla färgämnesekvivalenter. En intensivt färgad cell visar däremot oxiderat färgämne som hålls kvar, inte total vävnadsexponering eller effektstorlek. Samma försiktighet gäller i större skala: att jämföra färgning mellan celltyper eller betrakta ett mörkt vävnadssnitt som bevis för högre exponering upprepar det ursprungliga misstaget från cellskålen. Upptaget är en cykel av reduktion, diffusion och återoxidation, och varje enskild ögonblicksbild av den blå formen visar bara en del av den. De praktiska konsekvenserna för färgning och hantering i laboratoriet och för tolkningen av påståenden om dos och exponering följer direkt av detta.