Färgning med metylenblått: mikroskopimetoder och en atlas med verkliga bilder

Färgning med metylenblått gör annars svårurskiljbara celldetaljer lättare att skilja åt i ljusfältsmikroskopi. Det kan hjälpa elever att hitta en cellkärna i en kindcell eller undersöka mikroorganismers konturer och hur de ligger i förhållande till varandra. Ett blått objekt är dock en observation. Att namnge organismen, mäta den och avgöra om den tyder på sjukdom är separata uppgifter.

Omslagsbilden illustrerar kontrastprincipen. Atlasen nedan innehåller verkliga fotografier av oberoende dokumenterade prover, med ursprungliga källuppgifter.

Vad synliggör metylenblått?

Metylenblått är ett basiskt färgämne: dess färgade jon har en positiv laddning. Som OpenStax förklarar i sin genomgång av provfärgning samverkar basiska färgämnen med negativt laddat cellmaterial och kan få celler att framträda mot en ljusare bakgrund. I lämpliga preparat framhäver metylenblått nukleinsyrarika områden och andra strukturer som binder färgämnet.

Vid enkel färgning ger ett enda färgämne kontrast. Flera organismer kan därför se blå ut utan att vara samma organism. De användbara frågorna är till en början beskrivande: är objekten runda eller avlånga, enskilda eller i kluster, jämnt färgade eller med urskiljbara inre strukturer? Läs om skillnaden mellan enkel färgning och gramfärgning innan du tolkar färgen som ett klassificeringsresultat.

Kontrast och upplösning är olika saker. Kontrast hjälper till att skilja ett objekt från omgivningen; upplösning skiljer närliggande detaljer åt. En mörkare bild garanterar inte att fler strukturer kan urskiljas. Inte heller bör varje mörkt korn betecknas som en organell.

Ofärgade preparat, färgade våtpreparat och utstryk

Ett ofärgat, eller nativt, våtpreparat ger en bild utan tillsatt färgämne, även om provet fortfarande förändras när det tas ur sin ursprungliga miljö. I ett färgat våtpreparat tillsätts reagens medan materialet ligger kvar i vätska under ett täckglas. I ett fixerat utstryk sprids material på ett objektglas och fixeras med en angiven metod före fortsatt bearbetning. OpenStax översikt över preparering skiljer våtpreparat från fixering och förklarar varför fixerade organismer inte längre visar normal rörelse eller ämnesomsättning.

Dessa preparat besvarar olika frågor:

För en jämförelse i undervisningen dokumenterar du ett ofärgat preparat innan du undersöker ett separat färgat preparat som framställts enligt undervisningsprotokollet. Håll belysning och bildtagningsinställningar jämförbara. Om två olika celler fotograferas ska du beskriva dem som exempel, inte som en före- och efterdokumentation av samma cell.

Mikroskopiatlas: tre verkliga färgade preparat

Denna atlas är ett eget urval och en egen tolkning av tre mikrofotografier med öppna licenser. Upphovspersonerna anger vilka prover och färgämnen som använts. Vi har inte oberoende verifierat deras prover. Bilderna återges obeskurna som förlustfria WebP-konverteringar, utan tillagda detaljer eller färgändringar.

Bild 1: mänskliga kindceller

Prov: mänskliga kindceller. Färgämne: metylenblått. Förstoring: 400×, enligt fotografen. Skalstreck: saknas; källan anger ingen kalibrerad pixelstorlek. Fotografi av Fritzmann2002, 2017, från Mänskliga kindceller (färgning med metylenblått), licensierat under CC BY-SA 4.0. Denna återgivning behåller samma licens.

Börja med en enskild cell: dess mörkare cellkärna är lättare att skilja från den omgivande blå cytoplasman. Undersök sedan de överlappande cellerna nedanför den. Överlappning gör en gräns svårare att följa och kan skapa ett lokalt mörkare område. Använd bilden för att öva på att följa konturer, inte för att räkna varje mörk fläck som en cellkärna. Guiden för observation av kindceller utvecklar den provspecifika övningen.

Bild 2: lökceller

Prov: lökceller, enligt källans identifiering. Färgämne: metylenblått. Förstoring: “200x” finns i det ursprungliga filnamnet; uppgiften har inte verifierats oberoende. Skalstreck: saknas; ingen kalibrering anges. Fotografi av Alvy16, 2019, från Lökcell 200x, licensierat under CC BY 4.0.

De avlånga facken bildar ett ordnat skikt. Jämför deras långa gemensamma gränser med de oregelbundna konturerna i bild 1. Lägg också märke till det framträdande mörka materialet och den ojämna ljusstyrkan i synfältet. Fotografiet fastställer inte vad varje mörk avlagring är. Det visar varför en användbar observationsanteckning omfattar artefakter och osäkerhet i stället för att sätta en etikett på allt som tar upp färg.

Bild 3: jäst identifierad av källan som Candida spp.

Prov: Candida spp., enligt fotografen. Färgämne: enkel positiv färgning med metylenblått. Förstoring: saknas. Skalstreck: saknas; ingen kalibrerad pixelstorlek anges. Fotografi av Marta, Wikimedia-användaren Martunia.g, 2021, från Positiv färgning med metylenblått 2, licensierat under CC BY 4.0.

Jämför de täta blå klustren med de glesare kanterna. Enskilda konturer är lättare att följa där objekten överlappar mindre. Namnet Candida kommer från källuppgifterna, inte från en artbestämning utförd på detta fotografi. Bilden ger inte heller något resultat om viabilitet. Analyser av jästens viabilitet och respiration kräver egna betingelser, kontroller och tolkningar.

Att läsa skalan korrekt

Dessa bilder möjliggör visuella jämförelser, inte mätningar i mikrometer eller jämförelser av absolut cellstorlek mellan bilderna. Angiven förstoring kan inte ersätta saknad kamerakalibrering. Om en bilds visningsstorlek ändras, ändras också hur förstorad den uppfattas.

För dina egna bilder ska du upprätta en mätkalibrering med en känd standard och den aktuella optiska uppställningen. Nikons guide till mikrometri förklarar hur en objektmikrometer omvandlar godtyckliga indelningar i en bild eller ett hårkors till fysiska längder. Dokumentera objektivet, kamerakonfigurationen och kalibreringen och lägg till ett skalstreck utifrån dessa uppgifter. Härled inte ett skalstreck från en läroboks genomsnittliga cellstorlek.

Passar flaskans innehåll för metoden?

En flaska märkt metylenblått är inte en fullständig laboratoriespecifikation. Kontrollera koncentration och enheter, lösningsmedel, övriga ingredienser, avsedd användning, satsdokumentation och instruktioner. Ett reagens säkerhetsdatablad beskriver farorna; metodinstruktionerna anger hur det ska användas för det avsedda preparatet.

Ett konkret exempel är Mercks Löfflers metylenblåttlösning. Tillverkaren anger att den är ett mikroskopireagens och beskriver dess roll som kontrastfärg vid färgning av syrafasta organismer. Den angivna brandfarligheten visar också varför “en blå vätska” är otillräcklig information för att planera hantering eller uppvärmning. Dessa egenskaper gäller den beredningen, inte automatiskt varje vattenlösning av metylenblått.

På samma sätt är eosin-metylenblått-agar ett sammansatt odlingsmedium. Det är inte en objektglasfärgning som görs genom att tillsätta enbart metylenblått till ett prov. För ett annat avbildningssyfte kan du jämföra alternativ till metylenblått för mikroskopi.

För ett mikroskopkit för nybörjare börjar du med dess dokumenterade undervisningsmetod, kända färdigpreparerade objektglas och det angivna reagenset. Om en flaska har förlorat sin etikett eller dess sammansättning inte kan fastställas, ersätt den med ett lämpligt dokumenterat reagens. Använd ögonskydd och följ hanteringsinstruktionerna för den aktuella beredningen. Mänskligt material och okända miljöprover kräver undervisningslaboratoriets rutiner för provhantering och avfallshantering; färgning ersätter inte dessa rutiner.

Skriv observationen före slutsatsen

“Blå ovala objekt i kluster” är en välgrundad beskrivning av en bild. “En viss infektion” kräver underlag som bilden inte har gett. Håll provets ursprung, preparering, färgningsreaktion och identifieringsmetod åtskilda i anteckningsboken. Den åtskillnaden gör en enkel undervisningsbild användbar och förhindrar att ett tilltalande mikrofotografi får bära ett påstående som det inte kan stödja.