Članak
Tumačenje izgleda kolonija E. coli i drugih mikroorganizama na EMB agaru
Student zasejava nepoznati mikroorganizam tehnikom iscrpljivanja na eozin-metilensko plavi agar, inkubira ga preko noći i vraća se ploči sa tamnim kolonijama zelenkastog sjaja. U beležnici piše „E. coli, potvrđeno.“ Taj zapis tvrdi više nego što ploča može da potkrepi. Ploča pokazuje fenotip rasta i fermentacije u određenim uslovima. Identitet vrste je zaseban zaključak koji zahteva zasebne dokaze.
Ovaj vodič pristupa rezultatima na EMB agaru kao zadatku tumačenja. Objašnjava osnovni princip, vodi kroz ilustrativni atlas ploča sa kontrolama i navodi slučajeve u kojima udžbenički prikaz može da zavede.
Princip na kome se zasniva ploča
EMB agar je i selektivan i diferencijalan. Boje eozin Y i metilensko plavo suzbijaju mnoge Gram-pozitivne mikroorganizme, pa podloga pogoduje rastu Gram-negativnih mikroorganizama. Iste boje deluju kao indikatori: kada mikroorganizam fermentiše dostupni šećer i lokalno proizvede dovoljno kiseline, kolonija intenzivno vezuje boju i postaje tamnoljubičasta do plavocrna. Pri intenzivnom stvaranju kiseline površina kolonije može pokazivati metalnozelenu iridescenciju. ASM protokol za ploče sa eozin-metilensko plavim agarom opisuje ovu kombinaciju selekcije i diferencijacije i pruža referentne fotografije za nastavu.
Pre tumačenja bilo kog rezultata važan je jedan detalj: proverite koja se formulacija koristi. Starija formulacija Holt Harris Teague sadrži laktozu i saharozu, dok Levine EMB sadrži samo laktozu. Mikroorganizam koji fermentiše saharozu, ali ne i laktozu, kao što je slučaj sa mnogim izolatima Serratia marcescens, može izgledati drugačije na ove dve varijante. Dokumentacija proizvođača za EMB podloge izričito navodi ovu razliku u formulaciji. Zabeležite proizvođača i formulaciju u beležnicu uz rezultat.
Pripremljen nezasejan EMB agar obično je crvenosmeđ do crvenkastoljubičast, ponekad sa zelenkastom nijansom ili finim talogom. Ta boja podloge nije rast. Svako očitavanje uporedite sa nezasejanom pločom ili dokumentovanim početnim izgledom, a primarnu ploču očitajte nakon približno 18 do 24 sata aerobne inkubacije na 35 do 37 C, osim ako nastavni protokol ne propisuje drugačije. Produžena inkubacija može promeniti izgled koji nastaje usled fermentacije.
Kako posmatrati ploču
Koristite dve vrste osvetljenja. Najpre pregledajte ploču pod reflektovanom ili koso usmerenom svetlošću i nagnite je: metalni sjaj je iridescentan i može se pojaviti ili nestati sa promenom ugla posmatranja. Zatim je pregledajte u propuštenoj svetlosti da biste procenili boju kolonija i tamne centre. Posmatrajte dobro izolovane kolonije, jer gust rast i susedne kolonije menjaju lokalno nakupljanje kiseline i mogu oslabiti ili pojačati boju. ASM zbirka slika to neposredno pokazuje: E. coli u mešovitoj kulturi može izgubiti očekivani sjaj jer okolni mikroorganizmi menjaju kiselost sredine.
Uključite kontrole kad god vežba to dozvoljava. Uobičajeni nastavni skup čine E. coli ATCC 25922 za fenotip plavocrne boje i metalnog sjaja, nefermentator kao što je Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ili Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 za bezbojni fenotip i Gram-pozitivan mikroorganizam kao što je Enterococcus faecalis ili Staphylococcus aureus kao kontrola inhibicije, kako je navedeno u standardnim tabelama kontrole kvaliteta za EMB podloge. Ako pozitivna kontrola nema sjaj, prvo posumnjajte na inkubaciju, gustinu rasta ili formulaciju, pa tek onda na nepoznati mikroorganizam.
Ilustrativni atlas ploča
Ploče u nastavku su generisane ilustracije, a ne fotografije stvarnih kultura. One prikazuju obrazac koji treba tražiti, a ne tačnu nijansu bilo kog pojedinačnog soja. Uporedite ih sa ASM referentnim fotografijama i sa stvarnim pločama iz nastavne laboratorije.
Ploča 1: Escherichia coli na EMB agaru, intenzivan fermentator laktoze
E. coli na EMB agaru obično je tamnoljubičasta do plavocrna, često sa tamnim centrom i metalnozelenim sjajem usled intenzivnog stvaranja kiseline. Sjaj je poznati nalaz koji studenti traže, ali ga treba posmatrati kao potkrepljujući dokaz, a ne kao definiciju. Intenzitet sjaja zavisi od soja, vremena inkubacije, gustine kolonija i ugla posmatranja. Odsustvo sjaja ne isključuje E. coli, a tamna kolonija bez sjaja može ukazivati na više drugih fermentatora. Za svaki dalji postupak izaberite dobro izolovanu koloniju umesto da tumačite rast u gusto zasejanom sektoru.
Ploča 2: Klebsiella pneumoniae na EMB agaru, mukoidni fermentator
Klebsiella pneumoniae na EMB agaru obično formira velike, sjajne, mukoidne kolonije u ružičastoljubičastim do smeđeljubičastim nijansama, često sa tamnim centrima, ali uglavnom bez izraženog metalnog sjaja. Slična morfologija javlja se kod srodnih fermentatora, kao što je Enterobacter. Mukoidna tekstura i veličina kolonije deo su tumačenja: mala i ravna ružičasta kolonija ima drugačiji značaj od velike, kupolaste, mukoidne kolonije. Kao i kod E. coli, ploča ukazuje na fenotip fermentacije, a identifikacija na nivou vrste zahteva biohemijsku potvrdu opisanu u nastavku.
Ploča 3: Salmonella na EMB agaru i drugi nefermentatori, bezbojne kolonije
Salmonella na EMB agaru i srodni mikroorganizmi koji ne fermentišu laktozu, uključujući Shigella i mnoge izolate Pseudomonas, obično rastu kao bezbojne do prozirne ili bledoćilibarne kolonije. Neke formulacije i uslovi daju blagu ružičastu nijansu, pa bledoružičasta kolonija nije automatski fermentator. EMB ne razlikuje Salmonella od Shigella ili od drugih nefermentatora; za to su potrebni naknadni testovi. Imajte na umu i da su dokumentovani sojevi Salmonella koji fermentišu laktozu i formiraju kolonije sa metalnim sjajem nalik E. coli, što je još jedan razlog zbog kog jedna ploča ne može dati konačan odgovor.
Ploča 4: Serratia marcescens i zamka formulacije
Serratia marcescens zaslužuje poseban odeljak jer studenti često očekuju crvene kolonije, a zatim pogrešno protumače ploču. Većina kliničkih izolata ne fermentiše laktozu, pa na Levine EMB obično izgledaju bledo do slabo obojeno. Pošto mnogi izolati fermentišu saharozu, formulacija koja sadrži saharozu može dati tamniju reakciju ili izraženiju reakciju povezanu sa stvaranjem kiseline. Ne očekujte ni karakterističan crveni pigment prodigiozin na 35 do 37 C; stvaranje pigmenta nije pouzdano na temperaturi inkubacije. Kada protokol navodi Serratia marcescens na EMB agaru, proverite na koju formulaciju se ta tvrdnja odnosi. Pregled metabolizma Serratia sažima obrazac negativne fermentacije laktoze i promenljive fermentacije saharoze koji stoji iza ove zamke.
Ploča 5: kontrole i inhibirani mikroorganizmi
Gram-pozitivni mikroorganizmi kao što su Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus i Bacillus uglavnom su inhibirani ili im je rast izrazito suzbijen na EMB agaru, mada inhibicija nije potpuna kod svakog soja. Skup kontrola čini tumačenje utemeljenim: kontrola E. coli treba da pokaže dobar rast sa plavocrnom bojom i sjajem, kontrola nefermentatora treba da pokaže bezbojan rast, a kontrola inhibicije treba da pokaže oskudan rast ili odsustvo rasta. Ako kontrola inhibicije dobro raste, selektivnost podloge nije ostvarena i svako drugo očitavanje na toj seriji je upitno. Metode bojenja odgovaraju na drugačije pitanje od podloga za kultivaciju; za bojenje preparata na predmetnom staklu u laboratoriji pogledajte atlas bojenja metilenskim plavim.
Poređenje uz ograničenja
| Zapažanje na EMB agaru | Verovatno značenje | Šta ne utvrđuje |
|---|---|---|
| Tamna plavocrna kolonija sa zelenim sjajem u koso usmerenoj svetlosti | Intenzivna fermentacija, E. coli je vodeći kandidat | Identitet vrste; i drugi intenzivni fermentatori mogu pokazivati sjaj |
| Velika mukoidna ružičastoljubičasta kolonija, bez sjaja | Fermentator sa kapsularnim osobinama, Klebsiella je kandidat | Da je u pitanju baš Klebsiella pneumoniae; Enterobacter izgleda slično |
| Bezbojna ili prozirna kolonija | Mikroorganizam koji ne fermentiše laktozu, na primer Salmonella, Shigella, Pseudomonas | Koji je nefermentator u pitanju; za razlikovanje Salmonella od Shigella potrebni su drugi testovi |
| Bleda kolonija tamo gde se očekivala crvena | Moguće Serratia na EMB sa samo laktozom na 37 C | Odsustvo Serratia; proverite formulaciju i temperaturu |
| Odsustvo rasta ili sitne kolonije sa suzbijenim rastom | Moguća inhibicija Gram-pozitivnih mikroorganizama | Sterilnost ili identitet; neki sojevi izbegavaju inhibiciju |
Tri rečenice sažimaju izgled koji može da zavede. Tamna boja ne znači E. coli, jer Klebsiella, Enterobacter i drugi fermentatori razvijaju tamne centre bez sjaja. Ružičasta boja ne znači Klebsiella, jer umereni ili spori fermentatori i neki nominalni nefermentatori izgledaju ružičasto ili svetloljubičasto. Sjaj ne znači definitivno E. coli, jer ga mogu proizvesti i drugi intenzivni fermentatori. Nastavni protokol i njegovi prikazi mešovitih kultura ilustruju svaku od ovih grešaka.
Ograničenja potvrde
EMB agar pokazuje fenotip, a ne vrstu. Različiti mikroorganizmi mogu imati isti izgled kolonija, a isti mikroorganizam može odstupiti od svog udžbeničkog prikaza u zavisnosti od soja, starosti, gustine rasta, formulacije i inkubacije. Zato se u nastavnim i kliničkim postupcima morfologija na EMB agaru smatra preliminarnim pokazateljem.
Utemeljen postupak za studenta je sledeći: opisati izolovanu koloniju (veličina, boja, centar, sjaj u koso usmerenoj svetlosti, mukoidni karakter), zabeležiti formulaciju, vreme i temperaturu inkubacije i kontrole; zatim presejati dobro izolovanu koloniju da bi se dobila čista kultura pre bilo kog potvrdnog testa. Uobičajeni naredni postupci uključuju bojenje po Gramu i IMViC reakcije za preliminarnu identifikaciju E. coli i koliformnih bakterija, TSI ili KIA i biohemijske panele specifične za mikroorganizam za enterične mikroorganizme, uz serološku, MALDI TOF ili drugu validiranu identifikaciju kada zadatak to zahteva. Za osnovne informacije o mestu EMB među selektivnim i diferencijalnim podlogama za enterične mikroorganizme pogledajte uvodne tekstove o podlogama za kultivaciju enteričnih mikroorganizama i naknadnom bojenju po Gramu. Za povezano pitanje o tome šta bojenje preparata plavom bojom može, a šta ne može da dokaže, atlas bojenja metilenskim plavim u istom duhu razdvaja zapažanje od zaključka.
Zapišite zapažanje pre zaključka. „Tamne plavocrne kolonije sa zelenim sjajem koji zavisi od ugla posmatranja na Levine EMB nakon 24 sata, u skladu sa intenzivnom fermentacijom laktoze“ jeste utemeljen zapis. „E. coli, potvrđeno“ zahteva korak potvrde koji sama ploča ne može da pruži.