Članak
Test redukcije metilenskog plavog za mleko: princip i ograničenja
Studentkinja podiže dve epruvete sa mlekom. Jedna je postala bela za sat vremena. Druga je ostala plava pet sati. Pokazuje na plavu i kaže da je bezbedna za piće.
Taj zaključak otkriva pogrešno razumevanje testa. Test mleka metilenskim plavim ne utvrđuje bezbednost. Pokazuje koliko brzo mikrobna populacija u toj epruveti snižava redoks potencijal u zadatim uslovima. Spor rezultat znači nisku ukupnu metaboličku aktivnost u uzorku. Ne govori ništa o tome koji su organizmi prisutni, da li među njima postoji patogen ili da li je mleko pravilno pasterizovano.
Ta razlika je važna jer test deluje uverljivo. Plava boja nestaje. Sat daje broj. Brojevi podstiču preterano tumačenje. Ovaj članak zadržava korisno tumačenje i sprečava ono koje može dovesti do nebezbednih zaključaka.
Šta redukcija zapravo meri
Metilensko plavo je plavo u oksidovanom obliku, a gotovo bezbojno kada se redukuje u leukometilensko plavo. Sveže mleko sadrži rastvoreni kiseonik, koji održava boju plavom. Bakterije koje vrše respiraciju i fermentaciju troše taj kiseonik i oslobađaju redukujuća jedinjenja. Kada redoks potencijal dovoljno opadne, boja prima elektrone i gubi obojenost. Udžbenik mikrobiologije mleka Univerziteta u Gvelfu opisuje isti sled: uklanjanje kiseonika, a zatim stvaranje redukujućih supstanci tokom bakterijskog metabolizma.
Klasičan rad u časopisu Journal of Dairy Science opisuje to kao proces u dve faze: mikroflora najpre iscrpljuje kiseonik, a zatim sastojci mleka brzo redukuju boju. Zato je test redukcije metilenskog plavog za mleko najbolje razumeti kao funkcionalni test ukupne metaboličke aktivnosti, a ne kao brojač ćelija. Redoks ponašanje metilenskog plavog objašnjava hemiju te promene.
Kiseonik poništava krajnji rezultat reakcije. Redukovani leuko oblik boje izložen vazduhu ponovo se oksiduje i postaje plav. Mućkanje, presipanje, široke epruvete i veliki vazdušni prostor iznad uzorka zato odlažu rezultat. Tanak plavi prsten često ostaje na površini u dodiru sa vazduhom nakon što se ostatak sadržaja epruvete obezboji. Standardni postupci prihvataju taj prsten umesto da čekaju njegov nestanak.
Vrsta organizama unosi drugo odstupanje. Koliformne bakterije i mnogi mikroorganizmi mlečnokiselinske fermentacije brzo redukuju boju. Mnogi psihrotrofni i termodurični organizmi redukuju je sporo ili gotovo nimalo. Dva uzorka mleka sa istim brojem bakterija utvrđenim zasejavanjem na ploče mogu izgubiti plavu boju u razmaku od nekoliko sati. Već ta činjenica isključuje pretvaranje vremena u broj kolonija.
Kontrolisani laboratorijski postupak
Terenske i udžbeničke verzije razlikuju se u detaljima, pa rezultat važi samo u okviru metode kojom je dobijen. Uobičajena verzija za laboratorije za ispitivanje hrane izvodi se ovako:
- Uzmite uzorak sirovog mleka uz minimalno unošenje vazduha i odmah ga ohladite. Pre izdvajanja uzorka za test, promešajte ga blagim prevrtanjem.
- U sterilnu epruvetu odmerite 10 mL mleka i 1 mL radnog rastvora boje. Jedna često korišćena radna koncentracija iznosi 0.005 procenata boje, uz odnos mleka i boje 10 prema 1.
- Zatvorite epruvetu čepom, blago je prevrnite dva puta i u roku od nekoliko minuta stavite u vodeno kupatilo. Uobičajena temperatura inkubacije je 35 do 38 stepeni Celzijusa, u zavisnosti od konkretnog standarda. Zabeležite koji standard primenjujete.
- Tokom inkubacije zaštitite epruvete od svetlosti, jer svetlost ubrzava redukciju.
- Očitajte rezultat nakon 30 minuta, a zatim u fiksnim intervalima. Krajnja tačka je trenutak kada boja sadržaja epruvete odgovara referentnom uzorku prokuvanog mleka ili dostigne stepen obezbojavanja definisan postupkom.
- Sačuvajte netretiranu epruvetu sa istim mlekom kao vizuelnu kontrolu tamo gde metoda to zahteva.
Priručnik FAO za ispitivanje mleka daje izričitu terensku verziju ovog postupka: 10 mL mleka i 1 mL boje, zatvaranje čepom, blago prevrtanje, inkubacija na približno 37 do 38 stepeni i očitavanje svakih 30 minuta. U kontrolnim epruvetama koristi se prokuvano mleko kako bi se uništio prirodni redukujući sistem i obezbedila referenca za poređenje boje.
Gornja šema definiše okvir kontrolisanih uslova. Iste zapremine, ista boja, ista temperatura, isto mešanje, ista zaštita od svetlosti, isto pravilo za krajnju tačku. Promenite bilo koji od tih uslova i promeniće se i izmereno vreme. Zato kućne verzije sa proizvoljnom koncentracijom boje nisu uporedive sa laboratorijskim ocenama.
Na šta ukazuje vreme redukcije
Duže vreme znači nižu ukupnu aktivnost u navedenim uslovima. Kraće vreme znači višu ukupnu aktivnost. Nastavne tabele za mlekarstvo tim vremenima pripisuju okvirne ocene, na primer 5 ili više sati kao veoma dobro i manje od 30 minuta kao loše u jednoj šemi izvedenoj iz standarda BIS.
Ta razlika među šemama je ključna pouka. Rezultat od 5 sati nema univerzalnu ocenu. Pripada postupku koji ga je definisao. Zato opravdan format izveštavanja glasi:
MBRT iznosi X sati prema navedenoj metodi, što odgovara oceni prema toj metodi.
Nikada ne glasi: MBRT iznosi X jedinica koje formiraju kolonije po mL. Smernice izvedene iz Standard Methods navode da rezultate redukcije boje ne treba prijavljivati kao broj bakterija. Postupak jednostavnog bojenja metilenskim plavim takođe odgovara na drugo pitanje, jer pokazuje oblik ćelija pod mikroskopom, a ne ukupnu aktivnost u epruveti.
Tabela tumačenja i ograničenja
Ova tabela je izvorni referentni pregled za članak. Čitajte svaki red u celini. Nijedna ćelija ne može se tumačiti zasebno.
| Zapažanje ili tvrdnja | Na šta ukazuje | Šta ne može dokazati | Glavni ometajući faktori |
|---|---|---|---|
| Brz gubitak plave boje, za manje od 2 sata u jednoj šemi za sirovo mleko | Visoka redukujuća aktivnost, u skladu sa velikim mikrobnim opterećenjem ili slabom održivošću mleka pri čuvanju | Vrste, tačan broj, toksine ili neuspešnu pasterizaciju | Čuvanje na toplom, mikroflora bogata koliformnim bakterijama, svetlost, mala količina boje |
| Srednje vreme, 2 do 4 sata | Umerena aktivnost; ocena važi samo u okviru navedene šeme | Bezbednost ili odsustvo organizama koji sporo redukuju boju | Visoka temperatura inkubacije, razlike u aeraciji, izdvajanje masti |
| Spora redukcija, 5 ili više sati | Niska ukupna aktivnost u toj šemi | Odsustvo patogena, pasterizaciju ili hemijsku bezbednost | Ostaci antibiotika, konzervansi, dodatni rastvoreni kiseonik, velika količina boje |
| Plavi prsten ostaje na površini dok se ostatak sadržaja obezbojava | Ponovnu oksidaciju na granici sa vazduhom, uobičajeni rubni efekat | Neuspešan test ili nepotpunu reakciju | Široka epruveta, labav čep, ponovljeno otvaranje radi provere |
| Bela epruveta nakon inkubacije zagrevanog mleka | Izmenjen redukujući sistem i aktivnost preživelih mikroorganizama | Da je zagrevanje bilo ekvivalentno validiranoj pasterizaciji | Oštećenje toplotom, oporavak tokom inkubacije, naknadna kontaminacija |
| Bilo koja pojedinačna vrednost MBRT navedena bez metode | Nepoznate uslove testa | Bilo koju ocenu ili broj | Formulacija boje, odnos, temperatura, mešanje i pravilo za krajnju tačku nisu navedeni |
Provere zasnovane na rastu, poput uzgoja bakterija na hranljivim podlogama, ostaju način za određivanje broja i izolaciju. Epruveta za redukciju služi za skrining. Ploča služi za identifikaciju i brojanje.
Šta test ne može dokazati o bezbednosti
Spor rezultat ne može dokazati odsustvo patogena. Patogen prisutan u klinički značajnoj količini može malo doprinositi ukupnoj potrošnji kiseonika. Otkrivanje patogena zahteva metode specifične za dati organizam, što važeći Standard Methods tretira kao oblast odvojenu od opšteg skrininga kvaliteta.
Ne može potvrditi pasterizaciju. Provera termičke obrade koristi test alkalne fosfataze ili drugu validiranu metodu u skladu sa smernicama Codex-a za higijenu mleka i mlečnih proizvoda. Bela ili plava epruveta ne govori ništa o vremenskom i temperaturnom toku obrade te serije.
Ne može potvrditi bezbednost hrane. Bezbednost zavisi od patogena, već stvorenih toksina, ostataka lekova, hemijskih kontaminanata, istorije hladnog lanca i kontaminacije nakon uzorkovanja. Codex posmatra bezbednost mleka i mlečnih proizvoda kao lanac kontrolnih mera, a ne kao jedan rezultat skrininga.
Ispitivanje u laboratoriji za hranu nije kućno testiranje
U mlekarskoj laboratoriji test služi za skrining mleka pri prijemu, poređenje dobavljača tokom vremena ili podučavanje redoks mikrobiologije pod nadzorom. Uzorci imaju obezbeđenu sledljivost. Reagensi su standardizovani. Temperature se beleže. Otpad se zbrinjava kao laboratorijski otpad.
Kućno testiranje nema ništa od toga. Zapremine odmerene u kuhinji su približne. Koncentracije boja koje se prodaju na internetu veoma se razlikuju. Inkubacija se često odvija u toploj prostoriji umesto u kalibrisanom kupatilu. Promena boje se ipak dešava, pa rezultat deluje pouzdano iako nedostaje svaka kontrola koja mu daje značenje.
Veći rizik je u ponašanju koje rezultat podstiče. Plava epruveta kod kuće navodi na pijenje sirovog mleka koje bi laboratorija i dalje poslala na određivanje broja bakterija zasejavanjem na ploče, skrining patogena i proveru ostataka supstanci. Test mleka metilenskim plavim osmišljen je za ocenjivanje sirovog mleka pri prijemu, a ne za odobravanje mleka za konzumaciju. Brži skrining rezazurinom ima isto ograničenje: brže očitavanje boje, ali i dalje bez odgovora o patogenima.
Sažeto pravilo za laboratorijski sto
Standardizujte boju, odnos, temperaturu, mešanje, svetlost i krajnju tačku. Navedite vreme uz naziv metode i ocenu. Tumačite minute uz istoriju čuvanja, tip mikroflore, ostatke supstanci i kvalitet uzorkovanja. Kratko vreme ukazuje na aktivnost koju vredi istražiti. Dugo vreme nikada ne potvrđuje bezbednost.