Metilensko plavo u istraživanju zebrica: dodatak za uzgoj i ometajući faktor u eksperimentu

Voda za jaja zebrica često je blago plava, a gotovo niko ne beleži zašto. Boja je metilensko plavo, dodato protiv gljivica, a većina protokola tretira ga kao deo pozadine. Pozadina je ovde pogrešan pojam. Bolji je neprijavljeni eksperimentalni faktor: nešto što je prisutno u tretiranim posudama, a odsutno u kontrolama, farmakološki aktivno pri korišćenim koncentracijama i sposobno da promeni upravo one krajnje pokazatelje koje eksperiment meri.

Ta razlika određuje sve što sledi. Rutinska primena protiv gljivica tokom uzgoja jedno je pitanje. Da li je dodatak neutralan u odnosu na vaš test sasvim je drugo. Novija literatura o zebricama na prvo pitanje daje umirujući odgovor, a na drugo zabrinjavajući.

Šta smernice zapravo propisuju

Ne postoji jedinstven standard, što je deo problema. Smernice Kanadskog saveta za brigu o životinjama dozvoljavaju 0.5 mg/L, odnosno 0.00005%, u rastvoru za transport jaja i larvi radi smanjenja rasta gljivica. Evropske smernice za laboratorijske životinje opisuju držanje embriona u medijumu koji često sadrži istih 0.00005%. Receptura za E3 iz Cold Spring Harbor-a propisuje dvostruko više, 1 mg/L ili 0.0001%, kao sastojak recepture. Nasuprot tome stoji upadljivo izostavljanje: smernica OECD-a za ispitivanje toksičnosti na embrionima riba propisuje rekonstituisanu vodu za razblaživanje i ispitivanu hemikaliju, bez preporuke za metilensko plavo ni u verziji iz 2013. ni u kasnijoj reviziji. Tako jedna laboratorija od prvih sati života uzgaja embrione zebrica u plavoj vodi sa metilenskim plavim, druga sprovodi regulatorni test na embrionima u bistroj vodi, a obe svoj medijum smatraju uobičajenim. Svako ko poredi rezultate različitih laboratorija ili objedinjuje istorijske kontrolne podatke nasleđuje tu nedoslednost.

Radi boljeg razumevanja koncentracija, 0.00005% je približno 1.56 mikromolara, a 0.0001% približno 3.13 mikromolara. To su male vrednosti i lako ih je protumačiti kao preniske da bi bile važne. Studije u nastavku proveravaju upravo tu pretpostavku, pri upravo tim koncentracijama.

Čitaoci koji dolaze iz akvaristike, a ne iz laboratorije, susreću isti molekul u drugačijem okruženju, opisanom u akvarističkom vodiču za metilensko plavo. Hemija je ista; objašnjenje kako boja prenosi elektrone kroz ćelije pokazuje zašto se redoks-aktivno jedinjenje stalno pojavljuje u radovima o metabolizmu. Ono što sledi odnosi se konkretno na vodu za jaja zebrica sa metilenskim plavim.

Metabolizam: efekat menja predznak sa razvojnim stadijumom

Najinformativnija studija izlagala je zebrice koje se normalno razvijaju od prvog dana života do 5 dana nakon oplodnje i merila oksidativni metabolizam u svakom stadijumu, kako opisuje objavljeni izveštaj o eksperimentima metabolizma embriona. Obrazac vredi pažljivo opisati jer menja smer.

Na 1 dan nakon oplodnje, bazalna potrošnja kiseonika porasla je kod izloženih embriona pri obe koncentracije koje se koriste u uzgoju. Na 2 dana, potencijal mitohondrijske membrane u površinskom sloju larvi bio je povišen pri izlaganju koncentracijama od 0.00005%, 0.0001% i 0.0003%. Do 4 do 5 dana, nakon izleganja, predznak se promenio: oksidativna potrošnja energije se smanjila, bilo da je izlaganje bilo neprekidno od oplodnje ili akutno samo od 3. do 4. dana. Istovremeno su se smanjili nivoi transkripata za podjedinice mitohondrijskih respiratornih kompleksa i na 1 i na 4 dana, zajedno sa transkriptima povezanim sa steroidogenezom i glukoneogenezom.

Još dva zapažanja upotpunjuju sliku. Pri višoj koncentraciji koja se koristi u uzgoju, izleganje je počelo nešto ranije: izloženi embrioni prednjačili su na 2 dana, a kontrole su ih sustigle do 3. dana. Sama stresna osa, međutim, delovala je očuvano: kada su larve stare 5 dana izložene stresoru u vidu vrtloženja, nivo kortizola u celom telu normalno je porastao u obe grupe. Dakle, boja pri ovim dozama nije opšti razvojni otrov i ne prigušuje svaki fiziološki odgovor. Ona menja energetski metabolizam zavisno od stadijuma, povećavajući ga pre izleganja i smanjujući ga posle.

Ponašanje: zašto se dve studije ne slažu i zašto obe mogu biti u pravu

Literatura o ponašanju deluje protivrečno dok se planovi izlaganja ne uporede jedan pored drugog. Jedna studija bezbednosti u pogledu razvoja i ponašanja izlagala je embrione od približno 6 sati nakon oplodnje koncentracijama do 10 mikromolara, svakodnevno obnavljala rastvore do 4. dana, zatim prebacila larve u medijum bez boje tokom 5. i 6. dana i ispitivala lokomociju u testu svetlo–tama na 6. dan. Rezultat: nije bilo značajnog efekta na smrtnost, izleganje ili morfologiju, niti efekta tretmana na lokomociju. Autori su opravdano preporučili 10 mikromolara kao gornju granicu u svojim uslovima.

Druga grupa, sa delimično istim autorima kao u studiji metabolizma, sprovela je izlaganje onako kako se ono zaista odvija u uzgoju: boja je bila prisutna od 2 do 3 sata nakon oplodnje uz svakodnevno delimično obnavljanje, a ponašanje je mereno dok je izlaganje još trajalo ili ubrzo nakon njega. Pri istim rutinskim koncentracijama, larve su pokazale smanjenu lokomociju u 24-časovnom testu, što je potvrđeno kod različitih sojeva i u različitim laboratorijama, a studija ometajućeg uticaja na ponašanje povezala je efekat sa serotonergičkim tonusom, u skladu sa poznatim inhibitornim delovanjem boje na monoamin-oksidazu. Najrečitije je to što je medijum za embrione sa metilenskim plavim prikrio očekivani lokomotorni odgovor na fluoksetin, lek iz grupe SSRI. Skrining test sproveden u plavoj vodi zato može propustiti efekat leka koji bi se pokazao u bistroj vodi.

Stvarne protivrečnosti nema. Jedinjenje u jednom testu može da ne ostavi nikakav uočljiv preostali efekat dva dana nakon uklanjanja, a da u drugom i dalje deluje dok je prisutno. Praktično tumačenje je da rezultat bez uočenog efekta opravdava gornju granicu koncentracije, a ne tvrdnju o neutralnosti, dok rezultat sa uočenim efektom opisuje relevantan rizik: aktivno izlaganje tokom perioda merenja, upravo u uslovima koje koristi većina laboratorija.

Redoks boja unutar redoks testa

Još jedna zamka zaslužuje poseban pasus jer narušava merni sistem, a ne samu životinju. Alamar Blue test potrošnje energije i sam se zasniva na redoks hemiji: rezazurin se redukuje u fluorescentni rezorufin. Metilensko plavo takođe učestvuje u redoks reakcijama. U kontrolama bez ćelija, obe koncentracije koje se koriste u uzgoju blago, ali značajno, smanjile su fluorescenciju Alamar Blue nakon 24 sata. U eksperimentima sa životinjama, izloženi embrioni isprani su najmanje tri puta u medijumu bez boje pre testa, a biološki efekat kod izleglih larvi bio je veći od interferencije u odsustvu ćelija. Zato su obe tvrdnje tačne: isprane životinje pokazuju stvaran metabolički efekat, a neisprana boja tome dodaje direktan hemijski artefakt. Kontrole moraju da razdvoje ta dva uticaja, inače nijedna vrednost nema smisla. Opšte smernice za tumačenje rezultata testova zasnovanih na bojama ovde su naročito važne.

Vremenski pregled razvojnih stadijuma

Originalni pregled za ovaj članak. Koncentracije su dve standardne vrednosti za uzgoj, 0.00005% i 0.0001%, osim ako je navedeno drugačije.

Obrazac koji treba zapamtiti jeste rani porast i kasniji pad metaboličkih pokazatelja, uz efekte na ponašanje prisutne tokom izlaganja i neuočljive nakon eliminacije boje u jedinom testu koji je to proveravao.

Kontrolna lista za planiranje kontrola

Drugi originalni pregled. Koristite ga kada se protokoli za zebrice koji uključuju metilensko plavo primenjuju u eksperimentu.

1. Navedite boju kao reagens, a ne kao vodu. Prijavite koncentraciju i u procentima i u mikromolarima, početak i završetak izlaganja u satima ili danima nakon oplodnje, raspored obnavljanja i period uklanjanja boje pre svakog merenja.
2. Uskladite kontrole sa pitanjem. Studija ispitivane hemikalije zahteva kontrole bez boje; studija uzgoja zahteva grupe bez boje i sa bojom, uz beleženje ishoda u pogledu gljivica, jer nijedna navedena studija nije merila efikasnost protiv gljivica.
3. Isperite pre redoks testova, a zatim proverite. Isperite najmanje tri puta u medijumu bez boje i paralelno sprovedite kontrolu sa bojom i reagensom, ali bez ćelija, jer boja direktno smanjuje Alamar Blue signal.
4. Pokazatelje ponašanja i monoamina smatrajte visokorizičnim. Studije lokomocije, reakcije trzanja na iznenadni stimulus, ponašanja nalik anksioznosti, antidepresiva i inhibitora MAO treba da izbegavaju boju tokom merenja ili da dokažu neutralnost za konkretan pokazatelj; period uklanjanja boje od jednog do dva dana uklonio je jedan lokomotorni efekat, ali to nije dokazano za druge eksperimentalne paradigme.
5. Metaboličke i mitohondrijske pokazatelje smatrajte visokorizičnim u svakom stadijumu. Potrošnja kiseonika, potrošnja energije, membranski potencijal i transkripti respiratornog lanca menjaju se pri koncentracijama koje se koriste u uzgoju, u suprotnim smerovima pre i posle izleganja.
6. Ne prenosite zaključak o neutralnosti između različitih eksperimentalnih planova. Rezultat bez uočenog efekta nakon uklanjanja boje ne važi za izlaganje koje još traje; odsustvo morfološkog efekta ne obuhvata metabolizam ili interakciju sa lekom; rezultat za jedan soj, temperaturu ili trajanje testa ne važi za druge.
7. Navedite smernicu koju ste sledili i njenu alternativu. Izričito navedite koncentracije prema CCAC-u, evropskim smernicama ili Cold Spring Harbor-u i napomenite da OECD test na embrionima izostavlja boju, kako bi čitalac mogao da razume uslove u kojima su vaše životinje uzgajane.

Ništa od ovoga ne govori protiv upotrebe boje radi održavanja jaja u životu. Govori protiv toga da izbor načina uzgoja neproveren utiče na podatke. Plavetnilo u posudi potiče od molekula sa farmakološkim delovanjem, a eksperimenti koji će najverovatnije biti narušeni upravo su visokopropusni metabolički i neurobihevioralni skrininzi za koje se danas rado koriste mlade zebrice. Zabeležite ga, kontrolišite njegov uticaj, uklonite ga pre merenja i proverite test u kojem možda neprimetno učestvuje.