Testovi kvasca sa metilenskim plavim: brojanje živih ćelija naspram merenja vremena respiracije

Dve epruvete stoje na laboratorijskom stolu. Obe su plave. U jednoj, plave ćelije pod mikroskopom označavaju mrtav kvasac. U drugoj, prelazak epruvete iz plave u bezbojnu znači da je kvasac živ i da respirira. Ista boja, suprotna tumačenja. Pomešajte ova dva testa i svaki zaključak će biti obrnut.

Ta razlika je suština celog članka. Metilensko plavo je redoks boja: u oksidovanom obliku je plavo, a u redukovanom obliku je bezbojno leukometilensko plavo. Brojanje vijabilnih ćelija koristi tu hemiju za kratku mikroskopsku procenu. Eksperiment respiracije koristi je u reakciji celog uzorka čije se vreme meri. Svakom su potrebni sopstveni protokol, sopstvene kontrole i sopstvena doza skepticizma.

Brojanje vijabilnih ćelija: kratko bojenje, brzo očitavanje

Protokol koji se koristi u pivarstvu je najstandardizovanija verzija. Pripremite 0.01% w/v metilenskog plavog u 2% natrijum-citratu, pomešajte ga sa suspenzijom kvasca u odnosu 1:1 i pregledajte smešu nakon kratkog, unapred utvrđenog intervala. Objavljeni intervali variraju od 1 do 2 minuta u priručniku instituta Brewing Science Institute do oko 5 minuta u istraživačkim protokolima, dok OIV metoda za mikrobiologiju vina zahteva pregled u roku od 10 minuta. Konačna koncentracija boje u smeši za brojanje iznosi približno 0.005%. Napunite poboljšanu Neubauerovu komoru i pri uvećanju od oko 400x klasifikujte tamnoplave ćelije kao nevijabilne, a neobojene kao vijabilne. Svetloplave ćelije se u OIV metodi računaju kao žive, što već ukazuje na problem subjektivnosti o kojem se govori u nastavku.

Koncentracija ćelija određuje se na osnovu geometrije komore. Kada se prebroji ceo centralni kvadrat stranice 1 mm, broj ćelija po mL jednak je N puta faktor razblaženja puta 10^4, gde je N broj ćelija u toj oblasti, kako je navedeno u ASBC metodama za kvasac. Vijabilnost se računa jednostavnije: broj neobojenih ćelija podeljen ukupnim brojem ćelija, puta 100. Za procenu vijabilnosti prebrojte oko 400 ćelija, u skladu sa FEMS uporednom studijom u pivarstvu i praksom OIV-a. Dosledno primenjujte jedno pravilo za ćelije na granicama, na primer uključite ćelije na donjim i levim linijama mreže, a isključite one na gornjim i desnim.

Pravilo za pupoljke mora se utvrditi pre početka brojanja. Prema uobičajenoj konvenciji, pupoljak se računa kao zasebna ćelija kada dostigne približno polovinu veličine matične ćelije, a ako je manji, računa se zajedno s njom. Koje god pravilo izaberete, primenjujte ga na svaki kvadrat i zapišite na radnom listu kako bi ga sledeća osoba primenila na isti način.

Radni list za brojanje (odštampajte ga)

Ovaj radni list je originalni materijal za ovaj članak. Prepišite ga u svesku ili odštampajte po jedan primerak za svaki uzorak.

Vijabilnost (%) = 100 x neobojene / (neobojene + tamnoplave). Ukupan broj ćelija po mL = N x faktor razblaženja x 10^4, pri čemu je N broj ćelija u definisanoj oblasti komore. Zabeležite interval bojenja uz rezultat, jer vrednost vijabilnosti bez podatka o vremenu očitavanja nije ponovljiva.

Zašto vrednosti vijabilnosti variraju

Vreme očitavanja je prva smetnja i deluje u oba smera. Metabolički aktivne ćelije redukuju boju, pa prerano očitavanje može zateći žive ćelije pre nego što završe redukciju i pogrešno ih klasifikovati kao mrtve. Međutim, produžena izloženost je sama po sebi toksična i stvara zaista oštećene plave ćelije, što dovodi do lažnog bojenja koje ukazuje na smrt ćelija. Zato nastavni laboratorijski protokol propisuje ocenjivanje u roku od 5 minuta, kako je navedeno u nastavnom protokolu za kvasac iz Viskonsina. Pouzdana formulacija glasi da je ocenjivanje metilenskim plavim zavisno od vremena, pa treba odabrati jedan kratak interval i održavati ga istim za svaki uzorak u seriji.

Uzorci niske vijabilnosti nose drugu pristrasnost. Standardizovana metoda upozorava da metilensko plavo može preceniti stvarnu vijabilnost kada je ona ispod približno 80%, jer ćelije koje i dalje redukuju boju ne moraju zadržati sposobnost razmnožavanja. Literatura iz pivarstva opisuje istu nepouzdanost kada je vijabilnost znatno smanjena. Posmatrajte metilensko plavo kao brzu približnu procenu, a ključne odluke pri niskoj vijabilnosti, kao što je ponovno zasejavanje kulture, potvrdite brojanjem kolonija na pločama ili dopunskim bojenjem.

Uticaji matriksa su na trećem mestu. OIV metoda se izvodi pri pH blizu 4.6 i upozorava da uzorci niskog pH sa snažnim puferskim kapacitetom sprečavaju pravilno ponašanje boje. Takođe savetuje da se test ne koristi pri sadržaju šećera iznad 100 g/L, kada ćelije imaju obmanjujuće svetloplavo obojenje. Eksperimentalno poređenje pH pri bojenju pokazalo je znatne promene osetljivosti u ispitivanom rasponu, što je u skladu sa studijom metode sa metilenskim plavim zavisne od pH. Nečistoće su zasebna zamka: obojene čestice u nečistim kominama liče na mrtve ćelije i povećavaju varijabilnost među operaterima.

Ta varijabilnost je kvantifikovana, a ne zasnovana samo na pojedinačnim zapažanjima. U šestomesečnom ispitivanju u pivari, opisanom u FEMS poređenju metoda za kvasac, merenja metilenskim plavim u duplikatu imala su prosečnu standardnu devijaciju od 6.1%, naspram 0.2% za protočnu citometriju sa oksonolom, dok su se rezultati dva operatera za isti uzorak razlikovali za čak 13 procentnih poena. Kvantitativno poređenje metoda vijabilnosti iz 2023. godine pokazalo je da su fluorescentna mikroskopija i protočna citometrija znatno preciznije, ali i da učinak zavisi od vrste i matriksa. Klasičan opis metode koji su dali Painting i Kirsop (PMID 24430080) ostaje referentna tačka, a širi pregled testova vijabilnosti i vitalnosti kvasca (PMID 25154541) svrstava metilensko plavo među dopunske, a ne konačne testove. Tripansko plavo ovde nije automatski bolji izbor: ono pokazuje gubitak integriteta membrane, dok metilensko plavo pokazuje unos boje i redukcionu aktivnost, pa ćelije pod stresom mogu biti različito klasifikovane ovim dvema bojama.

Eksperiment respiracije: merite vreme nestanka plave boje

Drugi test uopšte ne koristi mikroskop. Kvasac, glukoza i razblaženo metilensko plavo stavljaju se u zatvorenu epruvetu, a meri se koliko je vremena potrebno da plava boja nestane. Tokom metabolizma ćelije stvaraju redukcione ekvivalente koji pretvaraju plavu boju u njen bezbojni oblik, dok je rastvoreni kiseonik ponovo oksiduje. Kada ćelije smanje količinu kiseonika, neto redukcija prevladava i sadržaj epruvete se obezbojava. Krajnja tačka zato odražava ravnotežu između respiracije, koncentracije boje i dostupnosti kiseonika. Rezultat treba navesti kao vreme redukcije ili obezbojavanja metilenskog plavog, a ne kao direktnu brzinu potrošnje molekularnog kiseonika.

Koristite mnogo razblaženiju boju nego pri određivanju vijabilnosti kako bi vreme reakcije bilo u praktičnom rasponu. AQA priručnik za obavezne praktične vežbe na A nivou dobro standardizuje ovaj postupak: 1 g glukoze na 100 mL vode zagrejane na približno 30 C, 5 g suvog kvasca dodatog neposredno pre upotrebe i radni rastvor boje koncentracije približno 0.001%, pripremljen razblaživanjem 0.1 mL osnovnog rastvora koncentracije 1% do 100 mL. Pomešajte 2 mL suspenzije kvasca i glukoze sa 2 mL radnog rastvora boje, ostavite da se temperatura izjednači sa temperaturom testa, protresite jednom tokom 10 sekundi, pokrenite tajmer i više ne tresite. Mućkanje ponovo unosi kiseonik i vraća plavu boju u epruvetu, što je najveći pojedinačni proceduralni artefakt. AQA navodi da bi pripremljena smeša obično trebalo da se obezboji u roku od oko 5 minuta na 35 C, uz prosečne vrednosti u ispitivanjima od 275 s na 20 C, 128 s na 35 C i 145 s na 45 C. To su primeri iz jedne eksperimentalne postavke, a ne univerzalne referentne vrednosti. Kvantitativnu vezu između brzine redukcije i metabolički aktivnog kvasca u kontrolisanim uslovima potvrđuju studije posvećene redukciji, uključujući rad indeksiran kao PMID 25773544 i studiju mehanizma objavljenu u časopisu Yeast (2014).

Prikaz vremenskog toka (originalni materijal)

Tabela ispod predstavlja originalni prikaz pripremljen za ovaj članak pomoću prethodno opisane postavke prema AQA protokolu: 2 mL smeše kvasca i glukoze plus 2 mL radnog rastvora boje koncentracije približno 0.001%, jedno mućkanje od 10 sekundi, a zatim inkubacija bez pomeranja. Unosi su primeri očitavanja u formatu koji bi grupa učenika trebalo da beleži, pri čemu je indeks brzine definisan kao 1 podeljeno vremenom obezbojavanja u sekundama. Izvedite eksperiment sa istim epruvetama i zamenite ove unose izmerenim vrednostima.

Prikažite indeks brzine u zavisnosti od temperature za epruvete A, B i C. Kriva raste, a zatim se zaravnjuje ili opada, što je očekivani obrazac procesa koji pokreću enzimi, a ne prava linija. Epruvete D, E i F nisu tačke podataka na toj krivoj. One su kontrole koje omogućavaju njeno tumačenje.

Kontrole koje svakom testu daju smisao

Svako izvođenje testa respiracije zahteva tri prateće kontrole. Prokuvani ili usmrćeni kvasac sa glukozom i bojom trebalo bi da ostane plav, čime se potvrđuje da brza redukcija zavisi od metabolizma živih ćelija. Živi kvasac sa bojom, bez dodatka glukoze, predstavlja kontrolu supstrata, ali ipak očekujte sporo obezbojavanje jer kvasac troši endogene rezerve. Glukoza sa bojom, bez kvasca, predstavlja hemijsku slepu probu. Ona je neophodna jer glukoza u alkalnoj sredini može redukovati metilensko plavo bez prisustva ćelija.

Brojanje vijabilnih ćelija zahteva drugačiju vrstu kontrole: doslednost postupka. Isti osnovni rastvor boje, isti odnos mešanja, isti interval bojenja, ista oblast komore, ista pravila za pupoljke i ćelije na granicama, uz slepo brojanje gde god je moguće. Kada se rezultati dva operatera razlikuju za deset poena, radni list obično otkriva uzrok: različito vreme očitavanja, različit prag plavog obojenja ili različita pravila za pupoljke. Tehnike pripreme i posmatranja obojenih ćelija povezane su sa metodama jednostavnog bojenja bakterija, dok se širi pregled onoga što boja obeležava u različitim uzorcima nalazi u atlasu mikroskopskog bojenja. Za fizičku osnovu kvantitativnog očitavanja bilo kog intenziteta plave boje, referentni podaci o apsorpciji označeni uslovima merenja objašnjavaju zašto svaki koeficijent mora biti naveden zajedno sa uslovima koji se odnose na rastvarač, pH i koncentraciju.

Izaberite test prema pitanju. Koliko je ćelija trenutno živo pitanje je brojanja, na koje se odgovara uz mikroskop i radni list. Koliko aktivno ova kultura respirira kinetičko je pitanje, na koje se odgovara štopericom i kontrolisanim epruvetama. Metilensko plavo služi za oba, ali nikada u istoj epruveti u isto vreme.