Metilensko plavo i progerija: pouke iz ćelijskog modela starenja

Promena jednog slova u jednom genu dovodi do toga da deca stare zastrašujućom brzinom. Gubitak kose, ukočeni zglobovi, sužene arterije i očekivani životni vek koji se završava u tinejdžerskim godinama. Ta bolest je Hačinson-Gilfordov sindrom progerije, a njena istraživanja godinama su bila usmerena na jedro, gde mutirani protein nanosi štetu. Studija Univerziteta Merilend iz 2016. postavila je drugačije pitanje: kako izgledaju mitohondrije u tim ćelijama? Odgovor je povezao dva odeljka ćelije, a plava boja poznata već čitav vek delovala je na oba.

Reč je o studiji autora Xiong i saradnika, objavljenoj u časopisu Aging Cell 2016. godine. U njoj se radilo isključivo sa ćelijama uzgajanim u kulturi. Ta činjenica određuje okvir svega što sledi. Nalazi su stvarni i konkretni. Jednako je jasno i koliko su udaljeni od bilo kakvog lečenja.

Model: jedna mutacija, jedan protein koji ostaje pričvršćen

Progerija počinje zamenom C u T na poziciji 1824 gena LMNA. Ta promena ne menja aminokiselinu. Ona aktivira skriveno mesto splajsinga, čime se iz proteina lamin A uklanja 50 aminokiselina. Skraćeni proizvod, nazvan progerin, gubi mesto cepanja koje bi ćeliji inače omogućilo da ukloni njegov farnezilni oslonac. Zato progerin ostaje trajno farnezilovan i pričvršćen za unutrašnju membranu jedra, dok bi se normalan lamin A naizmenično vezivao za nju i odvajao od nje.

Posledice u jedru dobro su dokumentovane i vidljive pod mikroskopom. Jedra stvaraju ispupčenja i nabore umesto da zadrže gladak ovalni oblik. Heterohromatin, gusto upakovana, transkripciono neaktivna DNK koja normalno oblaže rub jedra, proređuje se. Hiljade gena menjaju ekspresiju. Zamislite jedarnu laminu kao potpornu konstrukciju iza tapeta: kada se jedan deo konstrukcije zavari na pogrešnom mestu, zid se izboči, a šara na tapetama izobliči se po celoj prostoriji.

U studiji su korišćeni fibroblasti kože pacijenata sa progerijom, zajedno sa kontrolnim ćelijama sa istim brojem pasaža, kao i druga ćelijska linija izmenjena tako da normalni fibroblasti direktno proizvode progerin. U izmenjenim ćelijama razvili su se isti poremećaji, što ukazuje na progerin kao uzrok, a ne na prethodnu istoriju pacijenata ili vreme provedeno u kulturi. Težina poremećaja pratila je količinu progerina: linija koja je ispoljavala više progerina pokazivala je izraženije poremećaje u svim ispitivanim aspektima.

Kako su izgledale mitohondrije

Mitohondrije zdravih fibroblasta obrazuju razgranatu mrežu oko jedra, sa dugim tubulima koji se kreću duž putanja citoskeleta. U ćelijskim linijama progerije te mreže nije bilo. Veći udeo mitohondrija bio je fragmentisan, mnoge su bile otečene, a elektronska mikroskopija pokazala je približno dvostruko povećanje broja teško oštećenih organela. Snimanje u vremenskim intervalima pokazalo je da prelaze kraća rastojanja i kreću se sporije nego u kontrolnim ćelijama.

Funkcija je pratila oblik. Nivoi mitohondrijskog superoksida i oksidanasa u celoj ćeliji porasli su. Više ćelija pokazivalo je poremećen membranski potencijal. Proizvodnja ATP-a je opala. Ništa od toga, posmatrano zasebno, nije iznenađujuće, jer oštećene mitohondrije oslobađaju reaktivne vrste kiseonika i proizvode manje energije. Novina je bio predloženi uzrok. PGC-1alpha, transkripcioni koaktivator koji pokreće biogenezu mitohondrija preko nizvodnih faktora kao što su NRF1, TFAM i regulatori fuzije i fisije MFN1, MFN2, OPA1, FIS1 i DRP1, bio je potisnut približno osmostruko na nivou mRNA u ćelijama progerije, uz odgovarajuće smanjenje količine proteina. Izgledalo je da progerin potiskuje glavni prekidač za stvaranje i održavanje mitohondrija. Ta veza između oštećenja jedarne lamine i energetskog metabolizma deo je šireg razmatranja proizvodnje energije u mitohondrijama, dok je oksidativna strana iste ravnoteže obrađena u okviru oksidativnog stresa i kontrole ROS-a.

Šta je metilensko plavo promenilo

Istraživači su ćelije nedeljama neprekidno izlagali metilenskom plavom u niskoj, 100 nanomolarnoj koncentraciji. U kontekstu ćelijske kulture, to je dugotrajno, blago izlaganje, a ne kratak puls leka. Metilensko plavo prelazi između oksidovanog i redukovanog oblika i može da prenosi elektrone unutar mitohondrija, zbog čega se opisuje kao redoks jedinjenje koje deluje na mitohondrije, a ne kao običan antioksidans koji se troši kada neutrališe jedan oksidans.

Mitohondrije su reagovale i u normalnim ćelijama i u ćelijama progerije. ATP je porastao, nivoi oksidanasa su opali, a udeo mitohondrija sa teškim poremećajima se smanjio. Ekspresija PGC-1alpha delimično se oporavila, zajedno sa nekim od njegovih nizvodnih meta. Do ove tačke, reč je o opštem efektu podrške mitohondrijama, koji nije specifičan za progeriju.

Rezultati u jedru bili su iznenađenje i bili su specifični za ćelije zahvaćene bolešću. Kvantitativna analiza oblika pokazala je smanjenje ispupčenja jedra. Ukupne količine lamina A i C porasle su. Najupadljivija je bila preraspodela progerina: u netretiranim ćelijama progerije samo oko 30 procenata progerina nalazilo se u rastvorljivoj nukleoplazmatskoj frakciji, dok je ostatak bio pričvršćen za membranu. Nakon tretmana, rastvorljivi udeo porastao je na približno 65 procenata, blizu normalne raspodele lamina. Kada se oslobodi membrane, progerin povlači manje susednih proteina sa sobom, pa su se oporavile i rastvorljive frakcije lamina A i C.

Kao posledica tog oslobađanja, poboljšala su se dva fenotipska obeležja jedra. Perinuklearni heterohromatin, ispitan elektronskom mikroskopijom i bojenjem za heterohromatinski protein HP1-alpha, bio je vidljivo obnovljen. Sekvenciranje RNK pokazalo je i da se transkriptom približava normalnom stanju: netretirane ćelije progerije razlikovale su se od kontrolnih u više od 3,200 gena, dok su se tretirane ćelije progerije razlikovale u oko 1,670. U normalnim ćelijama isti tretman promenio je samo nekoliko desetina gena, što govori u prilog tome da je efekat u jedru povezan sa progerinom, a ne sa opštom promenom transkripcije. Načelo da ćelijski i životinjski modeli odgovaraju na uža pitanja nego što naslovi sugerišu objašnjeno je u članku kako čitati istraživanja o metilenskom plavom.

Zašto ovo nije lečenje

Četiri ograničenja zadržavaju ovu studiju tamo gde pripada: u laboratoriji.

Prvo, sve se odvijalo u posudama za kulturu. Fibroblasti u kulturi nemaju snabdevanje krvlju, imunološki kontekst, arhitekturu tkiva niti farmakologiju celog organizma koja određuje da li jedinjenje uopšte stiže do cilja. U ovom radu nijednoj životinji nije data doza i nijedan pacijent nije lečen.

Drugo, fibroblasti progerije predstavljaju model jednog tipa ćelije. Bolest dovodi do smrti prvenstveno kroz promene u arterijama, kostima i masnom tkivu, a studija je ispitala samo fibroblaste i jedan preparat glatkih mišića. Druga tkiva mogu se ponašati drugačije.

Treće, oporavak jedra nastao je nakon višenedeljnog neprekidnog izlaganja nanomolarnim koncentracijama u medijumu za kulturu. Koncentracije u posudi nisu doze, a ništa u radu ne pretvara 100 nanomolarnu koncentraciju u medijumu u režim primene kod ljudi. Metilensko plavo ima sopstveni odnos doze i odgovora i bezbednosni profil u drugim oblastima medicine, a ova studija ne pruža osnovu za kućnu upotrebu. Opšti bezbednosni kontekst nalazi se u članku bezbednost i neželjena dejstva metilenskog plavog.

Četvrto, progerija nije normalno starenje. To je retka bolest izazvana jednom mutacijom, pri kojoj se potporna konstrukcija jedra oštećuje na poseban način. Jedinjenje koje ublažava to specifično oštećenje u ćelijama uzgajanim u kulturi govori malo o starenju ljudi bez te mutacije. Ćelijski fenotip pruža uvid u međusobnu komunikaciju jedra i mitohondrija, a ne rezultat koji se odnosi na dugovečnost.

Zato je opravdan zaključak uslovan. U fibroblastima progerije, progerin potiskuje PGC-1alpha i ostavlja mitohondrije fragmentisanim, usporenim, sa visokim nivoima oksidanasa i manjkom energije. Metilensko plavo u niskoj koncentraciji obnovilo je pokazatelje funkcije mitohondrija u svim ćelijama, a u ćelijama zahvaćenim bolešću dodatno je oslobodilo progerin iz jedarne membrane, uz delimičan oporavak oblika jedra, heterohromatina i ekspresije gena. Zbog tog dvostrukog delovanja vredi poznavati ovu studiju. To ne čini metilensko plavo terapijom za progeriju ili starenje.