Metilensko plavo u laboratorijskim testovima za G6PD: šta boja zapravo radi

Student posmatra dve epruvete nakon inkubacije. U jednoj se pojavila očekivana boja. U drugoj nije. Student zaključuje da drugi pacijent ima deficit glukoza-6-fosfat dehidrogenaze. Taj zaključak možda jeste tačan, ali takvo zaključivanje preskače koncept na kojem test počiva. Ništa u epruveti ne meri enzim direktno. U epruveti se meri ono što enzim proizvodi, uz metilensko plavo kao posrednika.

Kada se razjasni ta posredna veza, postupak, kontrole i dugačak spisak pogrešnih rezultata više ne deluju proizvoljno.

Kratak odgovor

Metilensko plavo u testiranju za G6PD je redoks indikator. Enzim G6PD stvara NADPH, a sistemi zavisni od NADPH redukuju plavo metilensko plavo u njegov bezbojni leuko-oblik (ili ga koriste za prenos elektrona). Normalna aktivnost enzima omogućava efikasnu redukciju. Smanjena aktivnost dovodi do spore ili nepotpune redukcije. To je celokupan signal.

Dve istorijske metode koriste istu boju, ali se razlikuju po krajnjem pokazatelju. Ako ih jasno razdvojite, većina nedoumica nestaje.

Dva testa, jedna boja, različiti krajnji pokazatelji

Prvi je test direktne redukcije metilenskog plavog, koji su opisali Sass i saradnici, a kasnije procenio Gibbs. Ovde je krajnji pokazatelj sama boja: oksidovano, plavo metilensko plavo redukuje se u bezbojno leukometilensko plavo, a brzina te promene odražava kapacitet stvaranja NADPH. Izvorni rad o skriningu indeksiran je na PubMed-u pod Sass i sar. (1966).

Drugi je Brewerov test redukcije methemoglobina. Natrijum-nitrit najpre oksiduje hemoglobin u smeđi methemoglobin. Metilensko plavo zatim deluje kao posrednik u prenosu elektrona: redukovano metilensko plavo prenosi redukcione ekvivalente na methemoglobin, pretvarajući ga ponovo u crveni hemoglobin. Vidljivi krajnji pokazatelj je, dakle, smeđa naspram crvene boje, a ne plava naspram bezbojnog stanja. Originalna metoda objavljena je u Biltenu Svetske zdravstvene organizacije (Brewer i sar., 1960).

Nazivati Brewerov test testom obezbojavanja boje hemijski je neprecizno. Boja prolazi kroz ciklus; hemoglobin menja boju. Dijagram ispod prikazuje oba puta.

Reakcija na kojoj test počiva

G6PD katalizuje prvi oksidativni korak pentozofosfatnog puta:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Zreli eritrociti u velikoj meri zavise od ovog puta za snabdevanje NADPH, kao što je opisano u preglednom radu Luzzatta i saradnika u časopisu Blood (2020). NADPH održava glutation u redukovanom stanju i štiti ćeliju od oksidativnog oštećenja. Metilensko plavo uključuje se u ovaj sistem kao akceptor elektrona. Dovoljna aktivnost G6PD obezbeđuje dovoljno NADPH, što omogućava efikasnu redukciju. Niska aktivnost G6PD prekida lanac na njegovoj prvoj karici.

Zamislite boju kao pokazivač nivoa goriva, a ne kao motor. Ona ukazuje na snabdevanje NADPH. Sve drugo što menja to snabdevanje ili očitavanje rezultata može pomeriti kazaljku bez ikakve promene u genu.

Kako se izvodi postupak Brewerovog tipa

Sastav reagenasa menjao se tokom decenija, pa opis namenjen nastavi ne treba poistovećivati sa kliničkim protokolom. Svaka laboratorija sledi sopstveni validirani standardni operativni postupak. Uz tu napomenu, klasični postupak sa epruvetama izgleda ovako, u obliku dokumentovanom sa tri epruvete i inkubacijom od 3 sata u ovoj objavljenoj primeni:

1. Epruveta sa uzorkom pacijenta: puna krv uz dodatak glukoze, natrijum-nitrita i metilenskog plavog. Nitrit stvara methemoglobin, glukoza podržava metabolizam eritrocita, a boja omogućava prenos elektrona zavisan od NADPH.
2. Oksidovana kontrola: krv uz dodatak nitrita i glukoze, ali bez metilenskog plavog. Ona prikazuje smeđi krajnji pokazatelj methemoglobina, odnosno obrazac deficita.
3. Hemoglobinska kontrola: krv uz dodatak vode. Ona prikazuje crveni krajnji pokazatelj hemoglobina, odnosno normalan obrazac.
4. Inkubirajte sve epruvete na približno 37 C, obično tokom 3 sata, uz blago mešanje.
5. Razblažite mali alikvot iz svake epruvete u destilovanoj vodi da biste lizirali ćelije i omogućili jasno poređenje boja.
6. Uporedite epruvetu sa uzorkom pacijenta sa dve kontrole. Povratak ka crvenoj boji ukazuje na značajan redukcioni kapacitet. Zadržavanje smeđe boje ukazuje na izražen deficit.

Jedna istorijska formulacija koristila je oko 1 mL krvi sa reagensima približnih koncentracija od 180 mM natrijum-nitrita, 280 mM dekstroze i 0.4 mM metilenskog plavog. Te brojeve treba posmatrati kao primer iz literature, a ne kao univerzalnu specifikaciju.

Očitavanje rezultata

Kvalitativni skrining najbolje razlikuje rezultate oko praga od 30 do 40 procenata normalne aktivnosti, kako je razmotreno u ovom preglednom radu časopisa Malaria Journal o nedostacima u otkrivanju deficita G6PD. Normalan rezultat skrininga zato znači da test nije otkrio težak deficit. On ne potvrđuje potpuno normalnu aktivnost.

Zašto skrining može da zavara

Retikulocitoza nakon hemolize je klasičan uzrok lažno normalnog rezultata. Mladi eritrociti i retikulociti sadrže više G6PD od starih ćelija. Tokom akutne hemolitičke epizode najstarije ćelije, sa najvećim deficitom, možda su već uništene, pa ostaje mlada populacija čija aktivnost daje normalan rezultat na testu. Isti biološki proces dovodi u zabludu i kvantitativne testove, ne samo skrining testove sa bojom.

Nedavna transfuzija prikriva deficit jer eritrociti davaoca unose sopstveni enzim u uzorak. Mayo Clinic Laboratories navodi transfuziju među uzrocima nepouzdanih rezultata merenja enzima, uz retikulocitozu i interferenciju leukocita.

Heterozigotne žene predstavljaju najzahtevniji slučaj. Nasumična inaktivacija X-hromozoma stvara mešavinu normalnih eritrocita i eritrocita sa deficitom, pa ukupna aktivnost može biti bilo gde u rasponu od teškog deficita do naizgled normalne vrednosti. Kvalitativni skrining testovi često ne otkrivaju intermedijarne fenotipove. Dokumentacija SZO o testiranju za G6PD detaljno razmatra ovo ograničenje.

Starost uzorka, temperatura čuvanja, subjektivnost vizuelnog određivanja krajnjeg pokazatelja, hematokrit i kvalitet reagenasa dodaju analitički šum ovim biološkim uticajima.

Skrining nije dijagnoza

Rezultat skrininga koji ukazuje na deficit, intermedijarnu aktivnost ili nije u skladu sa kliničkom slikom zahteva kvantitativni test aktivnosti enzima G6PD. SZO smatra kvantitativnu spektrofotometriju uz kontrolu temperature referentnim pristupom. U tom testu, hemolizatu eritrocita dodaju se glukoza-6-fosfat i NADP+, a nastali NADPH prati se preko porasta apsorbance na 340 nm. Brzina promene proporcionalna je aktivnosti enzima, koja se obično normalizuje prema hemoglobinu i izražava u jedinicama po gramu. Aktuelna kliničko-laboratorijska praksa sažeta je u stavci kataloga testova Mayo Clinic za aktivnost G6PD.

Tumačenje se zasniva na referentnom opsegu koji je laboratorija validirala, često izraženom u odnosu na normalnu aktivnost u populaciji, pri čemu se deficit obično razmatra oko praga od 30 procenata, a intermedijarna aktivnost iznad njega. Ciljni profili proizvoda SZO za testove za G6PD (2022) definišu taj dijagnostički okvir. Ako nedavna hemoliza ili transfuzija čini određivanje fenotipa nepouzdanim, testiranje treba ponoviti nakon što se populacija eritrocita ponovo uravnoteži, a molekularno testiranje može pružiti dodatne informacije bez zamene merenja aktivnosti enzima.

Granica koju vredi sačuvati

Metilensko plavo u ovim testovima je ex vivo laboratorijski reagens. Ta činjenica pripada drugoj temi od bezbednosti primene metilenskog plavog kod pacijenta, koja je obrađena u smernicama o kontraindikacijama za metilensko plavo. Biohemija ih povezuje, jer lek takođe zavisi od redukcije zavisne od NADPH, ali boja u epruveti nije doza u krvotoku. Za kontekst o tome kako se boja ponaša kao sredstvo za bojenje u drugačijem okruženju, pogledajte principe bojenja metilenskim plavim, a za hemijsku grupu kojoj pripada, redoks boje u laboratoriji.

Skrining ispituje da li redukcioni kapacitet deluje očuvano. Potvrdno testiranje ispituje koliko enzima zapravo ima. Boja dobro služi za prvo pitanje, pod uslovom da niko od nje ne traži odgovor na drugo.