Metilensko plavo i ALS: zašto se rezultati razlikuju među eksperimentalnim modelima

Kada pretražujete metilensko plavo i ALS, nailazite na dve tvrdnje koje deluju protivrečno. Jedna kaže da je plava boja zaštitila neurone u modelima ALS-a. Druga kaže da nije imala nikakav efekat kod miša sa modelom ALS-a. Obe tvrdnje se pozivaju na stvarne naučne radove i oba rada zaslužuju da se ozbiljno razmotre. Protivrečnost nestaje kada jasno navedete načelo iza svakog eksperimenta: model određuje domet tvrdnje.

Rezultat kod crva jeste tvrdnja o crvu. Rezultat kod larve ribe jeste tvrdnja o larvi ribe. Nijedan nije tvrdnja o pacijentu dok to ne potkrepi ispitivanje toka bolesti kod sisara. Ovaj članak upoređuje dva najčešće citirana rada kako biste videli zašto se njihovi odgovori razlikuju.

Dva eksperimenta u jednoj tabeli

Držite ovu tabelu otvorenom dok čitate. U njoj su sve važne razlike između studija.

Razlikuju se genetika, vrste, put primene, vreme početka primene i ishodi. Genotip je samo jedna od pet razlika, pa ovaj par studija ne može da dokaže da metilensko plavo selektivno deluje na jedan patološki put u ALS-u. Dokazuje nešto uže, ali i dalje korisno: izraženo poboljšanje pri ranoj neposrednoj izloženosti u jednostavnim modelima nije se prenelo na tok bolesti kod sisara uz hroničnu oralnu primenu.

Pozitivan rezultat: šta je pokazala studija na crvima i ribama

U studiji na crvima i ribama iz 2012. godine mutirani ljudski TDP-43 ili FUS izraženi su u motornim neuronima crva, a mutirana ljudska mRNA ubrizgana je u embrione riba. To su modeli proteotoksičnosti. Oni tokom nekoliko dana reprodukuju toksične efekte mutiranog proteina na kretanje i oblik neurona, a ne celokupan višegodišnji tok ALS-a kod odraslih ljudi.

Tretman je počeo veoma rano. Crvi su od izleganja rasli na agaru koji je sadržao metilensko plavo. Embrioni riba proveli su noć u rastvoru supstance, počevši od 24 sata nakon oplodnje, a ponašanje je ispitano oko dva dana kasnije. Krvno-moždana barijera nije stajala između supstance i neurona na način na koji stoji kod sisara, a koncentracija supstance u plazmi ili mozgu nije merena.

U tim uslovima efekti su bili veliki i dosledni. I 6 i 60 μM smanjili su paralizu povezanu sa starenjem kod crva sa TDP-43 i FUS. Na 12. dan odraslog života oko 80 procenata netretiranih crva sa TDP-43 bilo je paralizovano, naspram oko 10 procenata crva tretiranih od izleganja. Test sinaptičke funkcije ukazao je na isto: crvi sa TDP-43 bili su preosetljivi na aldikarb, supstancu kojom se ispituje neuromišićni prenos, a metilensko plavo je pomerilo odgovor ka normalnom. Broj degenerišućih nastavaka motornih neurona se smanjio, uz najjasniji efekat pri 60 μM. Kod riba se plivanje izazvano dodirom znatno poboljšalo, a skraćeni motorni aksoni izrasli su bliže normalnoj dužini pri 30 ili 60 μM, mada je oporavak bio delimičan, a ne potpun.

Podaci o oksidativnom stresu uklapaju se u tumačenje zasnovano na antioksidativnom delovanju. Mutirani crvi i ribe imali su povišene pokazatelje reaktivnih kiseoničnih vrsta, koji su se smanjili uz tretman, a normalni crvi izloženi metilenskom plavom preživeli su prooksidativni izazov mnogo duže od netretiranih crva. Ipak, važna su dva ograničenja. Ukupne količine mutiranih proteina TDP-43 i FUS nisu se smanjile, a studija nije neposredno kvantifikovala proteinske agregate, pa pokazuje funkcionalno poboljšanje bez dokaza o uklanjanju agregata. Svako ko prati kako se obično formulišu redoks i mitohondrijske hipoteze treba da smatra da ovaj mehanizam ima potporu, ali da nije konačno utvrđen.

Vreme početka tretmana bilo je najpoučniji detalj. Kada su autori čekali do 5. dana odraslog života da započnu tretman, stopa paralize na 12. dan bila je oko 55 procenata, umesto oko 10 procenata uz tretman od izleganja. Ista supstanca, isti crv, ista mutacija, mnogo manji efekat. Rana profilaktička izloženost bila je zaslužna za veliki deo uočene koristi.

Rezultat bez značajnog efekta: šta je pokazala studija na miševima sa SOD1

Studija na miševima iz 2011. godine postavila je teže pitanje u zahtevnijem sistemu. Kod kongenih miševa sa SOD1 G93A bolest napreduje od tremora zadnjih ekstremiteta, preko poremećaja hoda i gubitka refleksa uspravljanja, do unapred definisanog završnog ishoda. Tretman je počeo pre pojave simptoma, na 45. dan, i nastavio se svakodnevno, dok su posmatrači ocenjivali neurološko stanje na skali od 0 do 6. Ovo je eksperiment koji prati celokupan tok bolesti, pa je bliži onome što je važno pacijentu nego bilo koja kriva paralize kod crva.

Glavni rezultati nisu pokazali značajan efekat. Ukupan početak simptoma nastupio je na 121. dan u kontrolnoj grupi, naspram 124. dana uz metilensko plavo, što nije bila značajna razlika. Preživljavanje do završnog stadijuma iznosilo je 167 dana naspram 170 dana, takođe bez značajne razlike. Nekoliko sekundarnih analiza išlo je u prilog tretmanu: kod ženki je početak simptoma bio odložen za oko 7 dana, a tretirane životinje provodile su nešto više vremena u blažim, a manje u težim stadijumima. Uz male podgrupe po polu i brojna poređenja stadijuma, ti nalazi služe za postavljanje hipoteza, a ne kao dokaz. Nisu merene ni brojnost neurona, ni agregacija SOD1, ni oksidativni ili inflamatorni markeri, pa studija takođe ne može da kaže da li je supstanca dostigla svoje mete i nije delovala ili pri ovoj dozi uopšte nije delovala na njih. Ispitana je samo jedna doza.

Sami autori istakli su najvažnije ograničenje, koje važi u oba smera. SOD1 G93A sa visokim brojem kopija dobro modeluje bolest izazvanu toksičnim SOD1, ali bolest povezana sa SOD1 čini mali deo porodičnog ALS-a i biološki se razlikuje od većine sporadičnih slučajeva. Predložili su ponovno ispitivanje kandidata u modelima sisara zasnovanim na TDP-43. Taj predlog je od tada postao složeniji, jer autori studije na crvima i ribama navode da ni zasebna studija metilenskog plavog na miševima sa TDP-43 nije poboljšala motorne ishode. Zato jedinjenje može da pokaže snažan efekat u jednom sistemu sa TDP-43, a da u drugom sistemu sa TDP-43 ne pokaže efekat. Sistem je važan koliko i gen.

Zašto poboljšanje kod crva ili ribe ne može da potvrdi korist za pacijente

Posmatrajte svaki model kao odgovor na drugačije pitanje.

Prvo, biologija se razlikuje. TDP-43 i FUS su proteini koji vezuju nukleinske kiseline i imaju zajedničke genetske interakcije u ovim jednostavnim sistemima, dok toksičnost SOD1 deluje kroz delimično različite neposredne mehanizme. Supstanca koja ublažava jedan proteotoksični stres ne mora da ublaži i drugi, a uspeh protiv prekomerne ekspresije u embrionima ne mora da predvidi uspeh protiv spore neurodegeneracije kod odraslih, praćene upalom, učešćem glijalnih ćelija i sistemskim propadanjem.

Drugo, izloženost se razlikuje. Neprekidna izloženost preko sredine pri mikromolarnim koncentracijama nije isto što i oralna primena. Apsorpcija u crevima, metabolizam prvog prolaza, vezivanje za proteine plazme, prodor u mozak i eliminacija stoje između progutane doze i motornog neurona kičmene moždine. Nijedna studija nije merila koncentracije supstance u nervnom sistemu, pa nijedna ne može da poveže svoju koncentraciju sa koncentracijom iz druge studije.

Treće, vreme početka se razlikuje. Koristi kod crva i riba snažno su zavisile od tretmana pre nego što su se patološke promene nagomilale. Tretman kod miševa takođe je počeo pre pojave simptoma, što je prednost, ali bi lečenje ljudi gotovo uvek počinjalo nakon pojave simptoma, dakle još kasnije. Profilaktički signal u dvodnevnom testu na embrionima polazna je tačka za istraživanje, a ne model kliničke upotrebe.

Četvrto, ishodi se razlikuju. Paraliza na 12. dan, osetljivost na aldikarb, dužina aksona u mikrometrima i preplivana udaljenost neposredni su fenotipski pokazatelji. Početak simptoma i preživljavanje kod sisara objedinjuju sve kompenzacione procese i procese koji usložnjavaju tok bolesti u organizmu. Lekovi često menjaju neposredne pokazatelje, a da ne menjaju preživljavanje, zbog čega postoje ishodi koji mere vreme do događaja kod sisara.

Čitaoci koji žele kontrolnu listu za sledeći naslov mogu je preuzeti iz članka kako čitati pretkliničke studije: pitajte koja je vrsta, koji je transgen, koja je doza i put primene, da li su merene koncentracije supstance, kada je tretman počeo u odnosu na patološke promene, da li je ishod bio kratkoročni fenotip ili tok bolesti i da li je efekat ponovljen u drugoj laboratoriji. Šira baza dokaza o metilenskom plavom kod ljudi i dalje je mesto na kome treba proveriti da li je neki od ovih ranih signala prerastao u kliničke podatke.

Šta ovo znači za pacijente i porodice

Iz ovih radova ne proizlazi nikakav utvrđen protokol primene metilenskog plavog za ALS. Pozitivna studija podržava dalja istraživanja oksidativnih i sinaptičkih mehanizama u biologiji TDP-43 i FUS. Studija bez značajnog efekta govori protiv očekivanja da hronična oralna primena pri ovoj izloženosti može da promeni tok bolesti tipa SOD1. Zajedno opisuju nedoslednost među modelima, a ne preporuku za lečenje.

Bezbednost zaslužuje isti trezven pristup kao i efikasnost. Studije ALS-a na miševima ne govore ništa o bezbednom doziranju kod ljudi, a metilensko plavo nosi stvarne rizike od hemolize pri nedostatku G6PD i serotoninske toksičnosti kada se kombinuje sa serotonergičkim lekovima. Sumnja na nedostatak G6PD, trenutna upotreba antidepresiva i svaka planirana promena terapije teme su za razgovor sa lekarom, kao i razmatranje opštih podataka o bezbednosti metilenskog plavog pre nego što bilo ko postupi na osnovu naslova o laboratorijskim nalazima.

Suština staje u jednu rečenicu. Metilensko plavo je pri ranoj izloženosti izazvalo izraženo poboljšanje fenotipova crva i larvi riba sa TDP-43 i FUS, a u studiji hronične oralne primene kod miševa sa SOD1 praktično nije donelo korist u pogledu početka simptoma ili preživljavanja, pa je pošteno tumačenje da dokazi zavise od modela i ne podržavaju primenu kod pacijenata.