Ko je razvio ljubičasto bojenje krvi? Metilensko plavo, Malachowski, Romanowsky i Giemsa

Eozin je crven. Metilensko plavo je plavo. Pomešajte ih, nanesite mešavinu na osušen razmaz krvi i delovi razmaza postaće ljubičasti.

Ne svi delovi. U dobro pripremljenom preparatu jedra belih krvnih zrnaca poprimaju crvenoljubičastu boju, a unutar parazita malarije hromatin poprima istu boju, dok okolna crvena krvna zrnca ostaju ružičasta, a citoplazma sivoplava. Upravo ljubičasta boja omogućava razlikovanje tipova ćelija.

Nijedna bočica ne sadrži ljubičastu boju. Ona se pojavljuje tek kada određeni proizvod razgradnje metilenskog plavog dođe u dodir sa eozinom na predmetnom staklu, a tokom 1880-ih i 1890-ih niko nije znao da taj proizvod postoji, a kamoli šta je. Ljudi koji su tragali za tom bojom radili su sami, sa nečistim bojama, bez pouzdanog načina da saznaju šta se nalazi u bočici nakon što je dva meseca stajala na polici.

Zato pitanje iz naslova ima više od jednog odgovora koji se može opravdati i zato se odgovor promenio 2011.

Rezultat koji se menjao sa mešavinom

Ovo bojenje nije nastalo jednim izumom. Razvijalo se postepeno. Svaka promena mešavine donosila je tačno jednu novu vidljivu informaciju, a redosled tih informacija najjasnije prikazuje ovu istoriju.

Važan je obrazac u poslednjoj koloni. Svaki napredak proširivao je raspon boja, a svako proširenje činilo je vidljivom još jednu strukturu. Ljubičasta boja nije ukras ove tehnike; ona predstavlja razliku između uočavanja prisustva parazita i uočavanja njegove građe. Kako je sama boja stigla iz BASF-ove fabrike boja u medicinu predmet je duže istorije, sa sopstvenom dokumentacijom. Ceo prethodni niz, sa izvorom za svaku stavku, nalazi se u hronologiji doprinosa sa vezama ka izvorima.

Slika: istih šest mešavina prikazanih kroz ono što je bilo u posudi i ono što je iz nje proizašlo. Krugovi predstavljaju boje u mešavini; blokovi ispod njih predstavljaju boje koje su one mogle da daju u razmazu krvi. Pre 1890 nema crvenoljubičastog bloka, a posle te godine nijedan prikaz ga ne izostavlja.

Čovek koji je namerno upotrebio boraks

Ernst Malachowski bio je lekar u Breslauu, današnjem Wrocławu, koji je karijeru proveo u privatnoj praksi i maloj klinici koju je vodio sa kolegom, baveći se laboratorijskim radom u slobodno vreme. Rođen je u Strzelnu 12. marta 1857, studirao je medicinu na Univerzitetu u Breslauu i od 1882 do 1887 radio kao asistent interne medicine u Bolnici Svih svetih, tada drugoj najvećoj bolnici u Nemačkoj.

Počeo je 1888 sa dvostrukim bojenjem koje su razvili Chęciński i Plehn. U preparatu napravljenom 1889 video je da se hromatin jedra plazmodijuma boji drugačije od citoplazme, a zatim ustanovio da to ne može da ponovi. Pokušao je da zakiseli metilensko plavo, što je pogoršalo rezultat. Pokušao je da ga alkalizuje boraksom, što je uspelo svaki put. Javno je demonstrirao metodu 15. juna 1890, a u avgustu 1891 objavio detaljniji opis, uključujući uputstvo za upotrebu boraksa. Naveo je da bojenje traje dvadeset četiri sata i da se rezultati lako mogu ponoviti.

Dvadeset četiri sata dugo je vreme za dijagnostičku laboratoriju, a njegov rad nije se zadržavao na ljubičastocrvenoj boji jedra parazita. Koji god da je razlog, niko nije primenio namernu alkalizaciju metilenskog plavog sve dok Nocht to nije ponovo uradio 1898. Malachowski više nikada nije pisao o bojenju krvi.

Razlog što se o njemu do skoro tako malo znalo leži u arhivima, a ne u nekoj misteriji. U medicinskoj literaturi gotovo da nije sačuvan nijedan trag njegovog života, a ono što je preživelo stiglo je jednim putem. Njegova ćerka Marie napustila je Nemačku i otišla u London 1939, služila u britanskoj vojsci i nastanila se u Kanadi, a njena zbirka porodičnih dokumenata završila je u Institutu Leo Baeck u Njujorku. Njen brat Leo poginuo je u Prvom svetskom ratu. Njena sestra Eva deportovana je iz Breslaua u tranzitni logor Izbica u aprilu 1942 i nikada se nije vratila. Njena majka Hedwig oduzela je sebi život 22. aprila 1942, umesto da čeka istu deportaciju. Malachowski je umro 1934, pre svih tih događaja.

Porodična istorija koja se tako završi jeste porodična istorija koja prestaje da se citira. Dva rada koja su Malachowskog vratila u istoriju razvoja ovog bojenja, oba objavljena 2011, sastavljena su na osnovu arhivskih dokumenata iz Poznanja i Wrocława i dokumenata njegove ćerke Marie u Njujorku.

Bočica sa plesni i jedan Rus koji je imao sreće

Dmitri Romanowsky studirao je medicinu na Vojnomedicinskoj akademiji u Sankt Peterburgu i veći deo karijere radio na malariji. Godine 1890 objavio je metodu koja je, na papiru, bila gotovo identična metodi koju je razvio Chęciński: neizmenjeno metilensko plavo i eozin, sa nešto više eozina.

U septembru 1891 objavio je metodu koja ga je proslavila, a važan detalj bio je zakopan u uputstvima. Najbolje rezultate dobijao je sa die vorräthige Methylenlösung, zalihom rastvora metilenskog plavog koji je stajao više od dva meseca i na kome je rasla plesan. Plesan i vreme stajanja delimično su demetilovali boju. Romanowsky to nije znao i nije mogao da kontroliše, a drugi istraživači koji su pokušali da primene njegovu metodu nisu uspevali da dobiju ljubičastu boju. Njegova teza predata je u Sankt Peterburgu u junu 1891, zbog čega se u uobičajenom prikazu 1891 smatra godinom otkrića.

Malachowski je svoju demonstraciju održao u junu 1890, više od godinu dana ranije, a njegova metoda davala je rezultat namerno.

Zašto je bojenje nazvano po pogrešnom čoveku

Argumente u prilog Malachowskom prikupili su Kristine Krafts, Ernst Hempelmann i Barbara Oleksyn, a oni počivaju na četiri stvari. Datum javne demonstracije: jun 1890 naspram septembra 1891. Reč namerno naspram reči slučajno. Činjenica da je Malachowski objavio svoju metodu, zajedno sa boraksom, dok je metoda koju je koristio Romanowsky zavisila od nekontrolisane promenljive. I zapažanje da je opis jedra plazmodijuma, zajedno sa ljubičastom bojom koja ga je otkrivala, praktično nestao iz literature na sedam godina, jer niko nije mogao da ponovi slučajnu verziju.

Zaključak iznose bez uvijanja. U biografskom radu takvu dodelu zasluga nazivaju „izrugivanjem istini“ i citiraju Ralpha Lillieja, koji je 1978 napisao da bi „možda ovu grupu bojenja trebalo da nazivamo bojenjima po Malachowskom“.

Tvrdnja je osporavana, kao što tvrdnje o prvenstvu obično jesu, a prirodu tog spora vredi objasniti, umesto presuditi. Rasprava o prvenstvu mora da odredi šta je bilo otkriće. Ako je otkriće ljubičasta boja, Malachowski ima raniju dokumentovanu demonstraciju. Ako je otkriće objavljena metoda, obojica su objavila radove 1891, a bojenje je nazvano po Romanowskom. Ako je otkriće objašnjenje, nijedan nema osnova da traži prvenstvo, jer nijedan nije znao da je sazrevanje zapravo demetilacija i nijedan nije mogao da objasni zašto se boja uopšte pojavljuje. Upravo tu poslednju stavku popularni prikazi preskaču. Aktivni sastojak bio je nečistoća koju niko nije identifikovao, a prvi čovek koji je boju namerno dobio učinio je to pomoću ponovljivog empirijskog recepta, a ne na osnovu razumevanja onoga što taj recept radi.

Dva rada iz 2011 predstavljaju najpotpuniji objavljeni prikaz argumenata u prilog Malachowskom, a oba su besplatno dostupna za čitanje na PubMed-u: opširan pregled na PMID 21235291 i biografski rad na PMID 21660627. PubMed zapis za pregled navodi i komentar na njega, objavljen u istom časopisu kasnije te godine na 86(5):366, što je primeren podsetnik da je argument bio osporavan u štampi čim se pojavio.

Ovaj spor nije neslaganje oko hemije. Svi učesnici slažu se oko toga šta je ljubičasta boja i koje je komponente proizvode. Neslaganje se odnosi na to ko je do nje prvi došao i na to da li se slučajnost koju niko nije mogao da ponovi uopšte računa kao uspeh.

Šta su donela kasnija imena

Ako je Malachowski prvi dobio ljubičastu boju, zašto bojenje nosi imena koja su mu dali Romanowsky, Wright i Giemsa?

Zato što rastvor za bojenje koji jednom uspe u rukama svog pronalazača još nije reagens. Kasniji rad pretvorio je nepredvidivu mešavinu u nešto što laboratorijski tehničar u drugoj zemlji može da upotrebi bilo kog utorka.

Nocht je do toga došao zaključivanjem. Pošto jednostavnom neutralnom bojom nije uspeo da dobije pouzdan rezultat, zaključio je da ljubičasta mora da potiče od nečega u metilenskom plavom što nije metilensko plavo i krenuo da to traži. Unna je već primetio da odležali rastvori metilenskog plavog boje granule mastocita crveno i pretpostavio da tokom sazrevanja boje nastaje nova supstanca. Bernthsen je 1885 pokazao da alkalni uslovi uklanjaju metil-grupe iz metilenskog plavog i da su ti proizvodi ono što danas nazivamo azurima. Nocht je hloroformom ekstrahovao aktivnu frakciju i mogao je da je nazove samo Rot aus Methylenblau, crveno iz metilenskog plavog; Michaelis ju je 1901 nazvao azur I. Jenner je rešio logistički problem. Ponovno rastvaranje taloga metilenskog plavog i eozina u apsolutnom metanolu dalo je jedan stabilan rastvor koji je fiksirao razmaz dok ga je bojio i uklonio potrebu za toplotnom fiksacijom. Leishman i Reuter spojili su polihromnu boju sa alkoholnim rastvaračem i dobili i stabilnost i ljubičastu boju. Wright je dvanaestočasovnu inkubaciju na 65 °C i deset dana stajanja zamenio jednim satom u struji pare. Giemsa je potpuno prestao da se oslanja na nasumično sazreo rastvor, koristeći odmerene količine poznatih boja sa glicerolom u metanolu kako bi proizvod izdržao tropsku vrućinu. Nikada nije objavio kako je pravio čist metilenski azur. Prodavao ga je laboratoriji dr Grüblera u Lajpcigu, koja ga je stavljala na tržište kao azur I i tvrdila da je samo njena verzija autentična boja po Giemsi.

O identitetu tog azura i dalje se raspravlja. Neki smatraju da je to jednostavno bilo polihromno metilensko plavo, drugi da je bilo bogato bojom Azure B. Odgovor je proizašao iz rata. Kada nemačke boje više nisu mogle da se nabave, tim Službe za javno zdravlje Sjedinjenih Država, Ralph Lillie sa Mauriceom Roeom i Aimee Wilcox, ustanovio je da najbolje bojenje daju tri odvojene komponente: neizmenjeno metilensko plavo, njegov demetilovani proizvod razgradnje Azure B i eozin. Azure B zamenio je nedostupni azur I, a te tri komponente i dalje su osnova bojenja koje se danas koristi za dijagnostikovanje malarije.

Hemija međusobnog delovanja te tri komponente na predmetnom staklu posebno je pitanje i tema druge stranice. Stranica uloge boja i hemija bojenja tipa Romanowsky objašnjava šta rade Azure B i eozin i zašto taj par daje boju koju nijedan ne daje samostalno. Stranica mikroskopija i laboratorijske primene obrađuje praktičnu stranu: šta određeni preparat pokazuje i kako proceniti da li je konkretan proizvod pogodan za metodu koju nameravate da koristite.

Deo istorije koji je i dalje aktuelan

Jedan detalj iz ove priče nije prestao da važi 1902. Otprilike pedeset godina najvažnija komponenta standardne boje za malariju širom sveta bila je neimenovana nečistoća. Bila je prisutna slučajno, njena količina razlikovala se od bočice do bočice, njen identitet je deo tog vremena bio poslovna tajna, a o njenom udelu raspravljalo se sve do 1940-ih. Ljudi koji su koristili tu boju nisu bili nemarni. Nisu imali način da saznaju šta je u bočici.

Savremena verzija istog problema jeste specifikacija koja opisuje samo deo materijala. Usaglašenost sa USP standardom put je do najviše čistoće koju tržište nudi, jer je reč o potpunom objavljenom standardu, a ne o jednom merenju: identitet, čistoća, organske nečistoće uključujući azurne boje, rezidualni rastvarači, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granice i bakterijski endotoksini. Blupreme nabavlja metilensko plavo od farmaceutskog proizvođača i objavljuje potpun sertifikat analize, tako da svaka stavka sa tog spiska može da se proveri, a ne samo da se tvrdi da je ispunjena. Sertifikat koji navodi rezultat ispitivanja teških metala i naziva ga usaglašenošću sa USP standardom današnji je ekvivalent bočice sa oznakom „sazrelo metilensko plavo“: možda sasvim dobar reagens, ali etiketa vam ne govori šta je u njemu.