Leximi i E. coli dhe i pamjeve të tjera të kolonive në agar EMB

Një student mbjell me vijëzim një mostër të panjohur në agar me eozinë dhe blu metileni, e inkubon gjatë natës dhe kthehet te një pjatë me koloni të errëta që shfaqin një shkëlqim të gjelbër. Shënimi në fletore thotë: "E. coli, e konfirmuar." Ky shënim pohon më shumë sesa mund të mbështesë pjata. Pjata tregon një fenotip rritjeje dhe fermentimi në kushte të caktuara. Identiteti i species është një pohim më vete, që kërkon prova më vete.

Ky udhëzues i trajton rezultatet në agar EMB si një detyrë interpretimi. Ai shpjegon parimin themelor, paraqet një atlas ilustrues pjatash me kontrolle dhe përshkruan rastet kur pamja e paraqitur në tekste mësimore mund të jetë çorientuese.

Parimi që qëndron pas pjatës

Agari EMB është njëkohësisht selektiv dhe diferencial. Ngjyruesit eozinë Y dhe blu metileni frenojnë shumë mikroorganizma Gram pozitivë, prandaj mjedisi favorizon rritjen e mikroorganizmave Gram negativë. Të njëjtët ngjyrues veprojnë si tregues: kur një mikroorganizëm fermenton sheqerin e disponueshëm dhe prodhon mjaftueshëm acid lokalisht, kolonia përthith shumë ngjyrues dhe merr ngjyrë nga vjollcë e errët në blu të zezë. Kur prodhimi i acidit është i fuqishëm, sipërfaqja e kolonisë mund të shfaqë një shkëlqim metalik të gjelbër irizues. Protokolli i ASM për pjatat me agar me eozinë dhe blu metileni përshkruan këtë ndërthurje të seleksionimit dhe diferencimit dhe ofron fotografi referuese për mësimdhënie.

Një hollësi ka rëndësi përpara leximit të çdo rezultati: kontrolloni cili formulim po përdoret. Formulimi më i vjetër Holt Harris Teague përmban laktozë dhe saharozë, ndërsa EMB Levine përmban vetëm laktozë. Një mikroorganizëm që fermenton saharozën, por jo laktozën, si shumë izolate të Serratia marcescens, mund të ketë pamje të ndryshme në këto dy versione. Dokumentacioni i prodhuesit për mjediset EMB e shpreh qartë këtë dallim mes formulimeve. Shënoni në fletore prodhuesin dhe formulimin krahas rezultatit.

Agari EMB i përgatitur dhe i painokuluar zakonisht ka ngjyrë nga kafe e kuqërremtë në vjollcë të kuqërremtë, ndonjëherë me një nuancë të gjelbër ose një precipitat të imët. Kjo ngjyrë e sfondit nuk është rritje. Krahasoni çdo lexim me një pjatë të painokuluar ose me pamjen bazë të dokumentuar dhe lexojeni pjatën fillestare pas rreth 18 deri në 24 orësh inkubimi aerob në 35 deri në 37 C, përveç rasteve kur protokolli mësimor përcakton ndryshe. Inkubimi i zgjatur mund të ndryshojë pamjen e fermentimit.

Si ta vëzhgoni pjatën

Përdorni dy lloje ndriçimi. Së pari, vëzhgojeni pjatën nën dritë të reflektuar ose të pjerrët dhe anojeni: shkëlqimi metalik është irizues dhe mund të shfaqet ose të zhduket në varësi të këndit të vëzhgimit. Më pas shqyrtojeni me dritë të transmetuar për të vlerësuar ngjyrën e kolonive dhe qendrat e errëta. Punoni me koloni të izoluara mirë, pasi dendësia e lartë dhe kolonitë fqinje ndryshojnë grumbullimin lokal të acidit dhe mund ta zbehin ose ta intensifikojnë ngjyrën. Grupi i imazheve të ASM e demonstron këtë drejtpërdrejt: E. coli në kulturë të përzier mund ta humbasë shkëlqimin e pritshëm, sepse mikroorganizmat përreth ndryshojnë mjedisin acid.

Përfshini kontrolle sa herë që ushtrimi e lejon. Një grup i zakonshëm për mësimdhënie përfshin E. coli ATCC 25922 për fenotipin me ngjyrë blu të zezë dhe shkëlqim metalik, një mikroorganizëm jofermentues si Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ose Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 për fenotipin pa ngjyrë dhe një mikroorganizëm Gram pozitiv si Enterococcus faecalis ose Staphylococcus aureus si kontroll frenimi, siç renditen në tabelat standarde të kontrollit të cilësisë për mjediset EMB. Nëse kontrollit pozitiv i mungon shkëlqimi, dyshoni fillimisht te inkubimi, dendësia e kolonive ose formulimi, përpara se të dyshoni te mostra e panjohur.

Atlas ilustrues pjatash

Pjatat më poshtë janë ilustrime të gjeneruara, jo fotografi kulturash reale. Ato tregojnë modelin që duhet kërkuar, jo nuancën e saktë të ndonjë shtami të veçantë. Krahasojini me fotografitë referuese të ASM dhe me pjatat reale nga laboratori mësimor.

Pjata 1: Escherichia coli në agar EMB, fermentuese e fuqishme e laktozës

E. coli në agar EMB zakonisht ka ngjyrë nga vjollcë e errët në blu të zezë, shpesh me një qendër të errët dhe një shkëlqim metalik të gjelbër nga prodhimi i fuqishëm i acidit. Shkëlqimi është tipari i njohur që kërkojnë studentët, por trajtojeni si provë mbështetëse dhe jo si përkufizim. Intensiteti i shkëlqimit ndryshon sipas shtamit, kohës së inkubimit, dendësisë së kolonive dhe këndit të vëzhgimit. Mungesa e shkëlqimit nuk e përjashton E. coli, ndërsa një koloni e errët pa shkëlqim sugjeron disa mikroorganizma të tjerë fermentues. Për çdo punë të mëtejshme, zgjidhni një koloni të izoluar mirë në vend që të bazoheni te leximi i një sektori me koloni të dendura.

Pjata 2: Klebsiella pneumoniae në agar EMB, fermentuese mukoide

Klebsiella pneumoniae në agar EMB zakonisht formon koloni të mëdha, të shndritshme, mukoide, me nuanca nga rozë-vjollcë në kafe-vjollcë, shpesh me qendra të errëta, por zakonisht pa shkëlqim të fortë metalik. Morfologji e ngjashme shfaqet te mikroorganizma fermentues të afërt, si Enterobacter. Tekstura mukoide dhe madhësia e kolonisë janë pjesë e leximit: një koloni rozë e vogël dhe e sheshtë ka peshë tjetër në interpretim nga një koloni e madhe, e ngritur si kupolë dhe mukoide. Ashtu si me E. coli, pjata sugjeron një fenotip fermentimi, ndërsa përcaktimi i species kërkon konfirmimin biokimik të përshkruar më poshtë.

Pjata 3: Salmonella në agar EMB dhe mikroorganizma të tjerë jofermentues, koloni pa ngjyrë

Salmonella në agar EMB dhe mikroorganizma të tjerë të afërt që nuk fermentojnë laktozën, përfshirë Shigella dhe shumë izolate të Pseudomonas, zakonisht rriten si koloni pa ngjyrë, gjysmë të tejdukshme ose me ngjyrë qelibari të zbehtë. Disa formulime dhe kushte japin një nuancë lehtësisht rozë, prandaj një koloni rozë e zbehtë nuk është automatikisht fermentuese. EMB nuk e dallon Salmonella nga Shigella ose nga mikroorganizmat e tjerë jofermentues; ky dallim bëhet me teste të mëvonshme. Vini re gjithashtu se janë dokumentuar shtame të Salmonella që fermentojnë laktozën dhe formojnë koloni metalike të ngjashme me E. coli, çka është një arsye tjetër pse një pjatë e vetme nuk mund të japë përfundimin përfundimtar.

Pjata 4: Serratia marcescens dhe kurthi i formulimit

Serratia marcescens meriton një seksion më vete, sepse studentët shpesh presin koloni të kuqe dhe më pas e lexojnë gabim pjatën. Shumica e izolateve klinike nuk fermentojnë laktozën, prandaj në EMB Levine zakonisht shfaqen të zbehta ose me ngjyrë të dobët. Meqë shumë izolate fermentojnë saharozën, një formulim që përmban saharozë mund të japë një reaksion më të errët ose më të lidhur me prodhimin e acidit. Mos prisni as pigmentin klasik të kuq prodigiozinë në 35 deri në 37 C; prodhimi i pigmentit nuk është i besueshëm në temperaturën e inkubatorit. Kur protokolli përmend Serratia marcescens në agar EMB, kontrolloni cilin formulim nënkupton pohimi. Një rishikim i metabolizmit të Serratia përmbledh modelin e mosfermentimit të laktozës dhe të fermentimit të ndryshueshëm të saharozës që qëndron pas këtij kurthi.

Pjata 5: kontrollet dhe mikroorganizmat e frenuar

Mikroorganizmat Gram pozitivë si Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus dhe Bacillus përgjithësisht frenohen ose rritja e tyre kufizohet ndjeshëm në agar EMB, megjithëse frenimi nuk është absolut për çdo shtam. Një grup kontrollesh e bën leximin të besueshëm: kontrolli i E. coli duhet të tregojë rritje të mirë me ngjyrë blu të zezë dhe shkëlqim, kontrolli jofermentues duhet të tregojë rritje pa ngjyrë dhe kontrolli i frenimit duhet të tregojë pak ose aspak rritje. Nëse kontrolli i frenimit rritet mirë, seleksionimi ka dështuar dhe çdo lexim tjetër në atë seri është i dyshimtë. Metodat e ngjyrosjes i përgjigjen një pyetjeje tjetër nga mjediset e kulturës; për ngjyrosjen e preparateve në laborator, shihni atlasin e ngjyrosjes me blu metileni.

Krahasim me kufij të përcaktuar

Tri fjali i përmbledhin pamjet çorientuese. Ngjyra e errët nuk do të thotë E. coli, pasi Klebsiella, Enterobacter dhe mikroorganizma të tjerë fermentues zhvillojnë qendra të errëta pa shkëlqim. Ngjyra rozë nuk do të thotë Klebsiella, pasi fermentuesit e moderuar ose të ngadaltë dhe disa mikroorganizma të konsideruar jofermentues shfaqen rozë ose me ngjyrë livandoje. Shkëlqimi nuk do të thotë identifikim përfundimtar i E. coli, pasi edhe fermentues të tjerë të fuqishëm mund ta prodhojnë atë. Protokolli mësimor dhe figurat e tij të kulturave të përziera ilustrojnë secilin prej këtyre rasteve çorientuese.

Kufijtë e konfirmimit

Agari EMB tregon një fenotip, jo një specie. Mikroorganizma të ndryshëm mund të kenë të njëjtën pamje kolonish, ndërsa një mikroorganizëm mund të devijojë nga pamja e tij në tekstet mësimore në varësi të shtamit, moshës, dendësisë së kolonive, formulimit dhe inkubimit. Prandaj procedurat mësimore dhe klinike e trajtojnë morfologjinë në EMB si tregues paraprak.

Një rrjedhë pune e mbështetur në prova për studentin është: përshkruani koloninë e izoluar (madhësinë, ngjyrën, qendrën, shkëlqimin në dritë të pjerrët, karakterin mukoid), shënoni formulimin, kohën dhe temperaturën e inkubimit dhe kontrollet; më pas bëni një nënkulturë nga një koloni e izoluar mirë për të përftuar një kulturë të pastër përpara çdo testi konfirmues. Hapat e mëtejshëm të zakonshëm përfshijnë ngjyrosjen Gram dhe reaksionet IMViC për identifikimin paraprak të E. coli dhe koliformëve, TSI ose KIA dhe panele biokimike specifike për mikroorganizmin për mikroorganizmat enterikë, si dhe identifikimin serologjik, me MALDI TOF ose me metoda të tjera të validuara kur detyra e kërkon. Për informacion bazë se si EMB përshtatet mes mjediseve enterike selektive dhe diferenciale, shihni materialet hyrëse për mjediset e kulturës enterike dhe testet pasuese pas ngjyrosjes Gram. Për pyetjen e lidhur se çfarë mund dhe çfarë nuk mund të provojë ngjyrosja e një preparati me blu metileni, atlasi i ngjyrosjes me blu metileni e mban vëzhgimin të ndarë nga përfundimi, sipas të njëjtit parim.

Shkruani vëzhgimin përpara përfundimit. "Koloni blu të zeza të errëta me shkëlqim të gjelbër që varet nga këndi i vëzhgimit në EMB Levine pas 24 orësh, në përputhje me fermentim të fuqishëm të laktozës" është një pohim i mbështetur në prova. "E. coli, e konfirmuar" kërkon hapin e konfirmimit që pjata e vetme nuk mund ta sigurojë.