Ndërtimi i një kurbe kalibrimi për blunë e metilenit: provat e bardha, intervali dhe lineariteti

Dy analistë përdorin të njëjtën shishe me tretësirë bazë të blusë së metilenit dhe secili ndërton një kurbë kalibrimi. I pari përfton një vijë të drejtë që kalon nga origjina dhe mat mostrat e panjohura me besim. I dyti përfton një vijë që lakohet në skajin e sipërm, një prerje me boshtin vertikal që nuk afrohet me zeron dhe rezultate mostrash që ndryshojnë me hollimin. I njëjti ngjyrues, i njëjti instrument, e njëjta gjatësi vale. Dallimi nuk qëndron te aftësia. Qëndron te projektimi: çfarë përmbante prova e bardhë, cilat përqendrime u zgjodhën dhe nëse intervali i kontrolluar mbeti brenda zonës ku një model i thjeshtë vazhdon të vlejë.

Një kurbë kalibrimi është një marrëveshje ndërmjet përgjigjes së instrumentit dhe përqendrimit, e vlefshme vetëm në kushtet në të cilat u ndërtua. Për blunë e metilenit, kjo marrëveshje ka një pikë të dobët të njohur. Ngjyruesi vetëshoqërohet në ujë, kështu që speciet që absorbojnë ndryshojnë me përqendrimin. Një kurbë e ndërtuar përgjatë këtij ndryshimi nuk do të jetë e drejtë dhe asnjë përpunim statistikor nuk do ta korrigjojë. Ky artikull tregon si ta projektoni kurbën që vija të ketë kuptim: zgjidhni provën e duhur të bardhë, mbajeni intervalin brenda regjimit monomerik, kryeni përsëritje të mirëfillta dhe lexojeni lakimin si informacion, jo si zhurmë.

Nisni me provën e bardhë, jo me standardet

Prova e bardhë përcakton zeron dhe, për blunë e metilenit, duhet të përmbajë gjithçka përveç ngjyruesit. E njëjta cilësi uji, i njëjti tampon dhe pH, të njëjtat kripëra, i njëjti fraksion bashkëtretësi, e njëjta temperaturë. Përgatitini tretësirat e kalibrimit në atë matricë identike. Arsyeja është kimike, jo burokratike. Kripa dhe tretësi zhvendosin ekuilibrin ndërmjet monomerit, dimerit dhe agregateve më të mëdha, gjë që ndryshon spektrin në gjatësinë e valës së matjes. Një provë e bardhë vetëm me ujë nuk mund të korrigjojë një ndryshim në shpërndarjen e specieve kimike të shkaktuar nga matrica. Analiza globale e spektrave të blusë së metilenit në ujë, e disponueshme përmes regjistrimit të saj me qasje të hapur, e ndryshoi përqendrimin e klorurit të natriumit nga 0 në 0.15 M pikërisht sepse forca jonike zhvendos ekuilibrin, dhe agregimi u rrit me shtimin e kripës.

Një pasojë praktike: mos kalibroni kurrë në ujë të dejonizuar dhe pastaj të matni mostra në tampon fosfat ose në filtrat ujërash të ndotura. Kur nuk ekziston një matricë pa analitin, shtimi standard drejtpërdrejt në mostër është më i përshtatshëm se një kurbë e jashtme me matricë të papërputhur. Udhëzime të lidhura për të ruajtur besueshmërinë e analizave në mjedis ujor gjenden në diskutimin mbi matricën dhe interferencat, ndërsa parimet e përgjithshme të analizave sasiore të ngjyruesve trajtohen në përmbledhjen e projektimit të analizave.

Zgjidhni një interval ku mbizotëron një specie

Përcaktimi sasior në brezin me gjatësi vale të madhe, pranë 664 nm, supozon se pjesa më e madhe e ngjyruesit është në formë monomerike. Në ujë pa shtesa, ky supozim vlen vetëm për sa kohë tretësirat mbeten të holluara, afërsisht në zonën e përqendrimeve të ulëta mikromolare. Pjerrësitë empirike të publikuara ilustrojnë kufirin: kalibrimet e mbajtura nën rreth 7 mikromolar në kiveta 1 cm japin një pjerrësi pranë 82,000 M-1 cm-1, ndërsa një kalibrim i shtrirë deri në rreth 37 mikromolar bie në afërsisht 67,100, sepse standardet e sipërme tashmë përmbajnë sasi të konsiderueshme dimeri. Çdo koeficient i cituar këtu shoqërohet me kushtet përkatëse në referencën spektrale për blunë e metilenit, që është vendi i duhur për të krahasuar vlerat; ky artikull i përdor ato vetëm për të përcaktuar intervalin.

Rregullat e projektimit rrjedhin drejtpërdrejt:

1. Mbajeni standardin me përqendrimin më të lartë mjaftueshëm të holluar që forma e spektrit të jetë e qëndrueshme. Gjatë zhvillimit, skanoni të gjithë intervalin e dukshëm (rreth 550 deri në 750 nm) për çdo nivel, në vend që të matni vetëm në një gjatësi vale. Nëse spektrat e normalizuar ndryshojnë formë me përqendrimin, kimia po ndryshon dhe intervali është tepër i gjerë.
2. Ndiqni raportin e absorbancës pranë 610 nm ndaj absorbancës pranë 665 nm në të gjitha nivelet. Një raport që rritet me përqendrimin tregon se shpatulla spektrale e dimerit po rritet dhe modeli monomerik nuk vlen më. Ky tregues diagnostik shpjegohet më tej në udhëzuesin për agregimin dhe efektet e përqendrimit.
3. Përdorni një kivetë 1 cm për punë me përqendrime të ulëta mikromolare. Me një pjerrësi pranë 82,000, një përqendrim 5 mikromolar jep absorbancë pranë 0.41 dhe një përqendrim 10 mikromolar jep rreth 0.82, të dyja të përshtatshme për shumicën e instrumenteve.
4. Për tretësirat bazë të përqendruara, shkurtoni rrugën optike në vend që të pranoni absorbancë shumë mbi 1, por mbani mend se një rrugë e shkurtër korrigjon fotometrinë, jo kiminë. Agregimi varet nga përqendrimi, jo nga gjatësia e rrugës optike, prandaj një tretësirë bazë e përqendruar ende kërkon trajtimin e vet që merr parasysh speciet kimike, jo një kurbë monomerike për tretësira të holluara.

Përshtatja globale që mbështet pjesën më të madhe të kësaj tabloje përfshiu 224 spektra nga 1.1 mikromolar deri në 3.4 milimolar dhe gjeti se sinjali i tetramerit ishte tashmë i dallueshëm nën 34 mikromolar. Ky rezultat përcakton qasjen: zona lineare është më e ngushtë nga sa sugjeron intuita, ndaj verifikojeni në vend që ta supozoni.

Nivelet, përsëritjet dhe rendi

Një kurbë me tre pika nuk provon asgjë. Udhëzimi për validimin në ICH Q2(R2) kërkon të paktën pesë përqendrime për të vlerësuar linearitetin, ndërsa gjashtë deri në tetë nivele jozero japin një kurbë pune më bindëse, veçanërisht pranë skajit të sipërm ku nis agregimi. Shpërndajini nivelet që të mbulojnë intervalin e synuar të mostrave, me dendësi më të madhe aty ku lakimi ka më shumë gjasa, jo në një varg gjeometrik të zgjedhur për lehtësi.

Mateni çdo nivel në dy ose tri përsëritje, të përgatitura në mënyrë të pavarur, në vend që të lexoni tri herë nga e njëjta balonë. Përsëritjet e pavarura zbulojnë gabimin e përgatitjes; leximet e përsëritura të së njëjtës balonë zbulojnë vetëm zhurmën e instrumentit. Studimi global i vitit 2020 e mati çdo tretësirë tri herë, gjë që mbetet një zgjedhje fillestare e arsyeshme. Rastësoni rendin e leximit që zhvendosja e sinjalit, adsorbimi në xham ose ndryshimi i temperaturës të mos paraqiten si lakim. Një studim me kiveta kuarci gjeti se rreth 3 për qind e ngjyruesit nga një tretësirë 34 mikromolar adsorbohej brenda 10 minutash, prandaj mbajini kohën e kontaktit, kivetën, pastrimin dhe sekuencën të njëtrajtshme gjatë serisë së matjeve.

Shembull ilustrues i zgjidhur (jo të dhëna të matura)

Numrat më poshtë janë të sajuar për të treguar llogaritjet. Nuk janë matje laboratorike dhe nuk duhen cituar si të dhëna për blunë e metilenit. Rëndësi ka mënyra e kryerjes së kontrolleve që i shoqërojnë.

Supozoni gjashtë standarde në tampon të përputhur, me rrugë optike 1 cm, të lexuara në 665 nm kundrejt provës së bardhë të përputhur:

Përshtatja e absorbancës mesatare ndaj përqendrimit me një vijë të drejtë jep një pjerrësi pranë 0.0805 njësive të absorbancës për mikromolar dhe një prerje me boshtin vertikal brenda pak njësive të miliabsorbancës nga zeroja. Pjesëtimi i pjerrësisë me gjatësinë e rrugës optike e shndërron atë në një absorptivitet të dukshëm: 0.0805 për mikromolar është e barabartë me rreth 80,500 M-1 cm-1, në përputhje me një interval ku mbizotëron monomeri në ujë. Kontrollet që kanë rëndësi nuk janë R në katror, i cili do të duket i shkëlqyer në të dyja rastet. Ato janë prerja pranë zeros, raporti i pandryshueshëm A610/A665 nga S2 deri në S5 dhe mbetjet e shpërndara pa ndonjë prirje. Rritja e lehtë e raportit te S6 është sinjali i qartë për ta përjashtuar atë nivel ose për ta shënuar përqendrimin 7 mikromolar si kufirin e sipërm provizor për këtë kombinim matrice dhe instrumenti.

Një mostër e panjohur e lexuar në 0.245 në kushte identike shndërrohet drejtpërdrejt: 0.245 pjesëtuar me 0.0805 për mikromolar jep rreth 3.0 mikromolar, përpara zbatimit të çdo faktori hollimi të mostrës. Raportojeni rezultatin bashkë me kushtet e tij: gjatësinë e valës, rrugën optike, matricën e provës së bardhë, intervalin e kalibrimit dhe datën.

Fletë pune e plotësueshme për kalibrimin

Kopjojeni këtë model në regjistrin laboratorik për çdo matricë të re. Një matricë, një fletë, një kurbë.

Rreshti për formën e reagentit ka arsye të jetë aty. Bluja e metilenit që shitet mund të jetë kripë anhidre ose një hidrat, si trihidrati, dhe masa molare e gabuar shkakton, pa u vënë re, devijim në çdo përqendrim nominal. Kontrollet e pastërtisë dhe të specifikimeve për materialin fillestar trajtohen në udhëzuesin për cilësinë dhe shkallën e pastërtisë.

Verifikoni me një standard kontrolli të pavarur

Një kurbë kalibrimi nuk duhet të vlerësojë kurrë vetë punën e saj. Pas përshtatjes, përgatitni një standard kontrolli nga një tretësirë bazë e përgatitur me peshim të veçantë, në një përqendrim pranë mesit të intervalit të pranuar, dhe lexojeni si një mostër të panjohur. Përputhja brenda pak për qind konfirmon zinxhirin e përgatitjes; një mospërputhje sugjeron problem te tretësira bazë ose hollimet, jo tek instrumenti. Përsëriteni standardin e kontrollit me çdo seri mostrash. Nëse ai ndryshon ndërkohë që kurba mbetet e pandryshuar, dyshoni te tretësirat e punës ose kiveta përpara se të dyshoni te mostrat. Ky zakon i vetëm kap shumicën e gabimeve të fshehta: një masë molare hidrati e përdorur për një shishe me material anhidër, një mikropipetë jashtë kalibrimit, një tampon i përgatitur me forcë jonike të gabuar. Shënoni rikuperimin e standardit të kontrollit në fletën e punës pranë pjerrësisë, që një lexues i mëvonshëm të shohë se vija është testuar, jo thjesht vizatuar.

Interpretimi i jolinearitetit si diagnozë

Kur kurba lakohet, forma e devijimit identifikon shkakun. Lakimi për poshtë në absorbancë të lartë, me formë spektrale të pandryshuar, tregon problem tek instrumenti, shpesh dritë e parazitshme që i bën absorbancat e larta të duken më të ulëta. Lakimi i shoqëruar me një shpatull spektrale në rritje në 610 nm tregon ndryshim në kimi: dimeri dhe agregatet më të mëdha absorbojnë ndryshe nga monomeri. Një provë e bardhë që nuk zeron, ose standarde që bien me kalimin e kohës, tregojnë problem tek ena: adsorbim në xham ose në kiveta, veçanërisht nëse kohët e kontaktit ndryshonin gjatë serisë së matjeve. Dhe një vijë e pastër që kalon nëpër pikat, por ende jep rezultate të gabuara për mostrat, tregon problem te matrica: mostrat ndryshojnë nga tretësirat e kalibrimit, ndaj rindërtojeni kurbën në matricën e mostrës ose kaloni te shtimi standard. Në çdo rast, paraqitini grafikisht mbetjet kundrejt përqendrimit. Një shpërndarje e rastësishme mbështet modelin e vijës së drejtë; një formë e lakuar si buzëqeshje ose si fytyrë e ngrysur e hedh poshtë atë më me besueshmëri se çdo prag i R në katror, një pikë që udhëzimi për validimin e mbështet shprehimisht.

Bluja e metilenit e shpërblen këtë disiplinë. Brezi i saj monomerik është i fortë, kimia e saj është studiuar mirë dhe mënyrat si dështon shfaqen në spektër përpara se të shtrembërojnë numrat. Ndërtojeni kurbën në një interval të ngushtë, korrigjojeni me një provë të bardhë të përputhur siç duhet, kryeni përsëritje të pavarura dhe lëreni formën e spektrave të vendosë për intervalin. Vija që rezulton është e shkurtër, por çdo pikë në të është e vërtetë.

Llogaritjet ilustruese në këtë artikull përdorin numra të sajuar për të demonstruar metodën. Koeficientët referues të matur, bashkë me kushtet e plota, gjenden në referencën spektrale të lidhur, dhe studimi bazë i agregimit është i indeksuar te PMID 33251415.