Artikull
Bluja e metilenit në testet laboratorike të G6PD: çfarë bën në të vërtetë ngjyruesi
Një student vëzhgon dy epruveta pas inkubimit. Njëra ka marrë ngjyrën e pritshme. Tjetra jo. Studenti arrin në përfundimin se pacienti i dytë ka mungesë të glukozë-6-fosfat dehidrogjenazës. Ky përfundim mund të jetë i saktë, por arsyetimi anashkalon konceptin që mundëson funksionimin e testit. Asgjë në epruvetë nuk e mat drejtpërdrejt enzimën. Epruveta mat atë që prodhon enzima, duke përdorur blunë e metilenit si ndërmjetës.
Pasi të kuptohet kjo matje e tërthortë, procedura, kontrollet dhe lista e gjatë e rezultateve të rreme nuk duken më arbitrare.
Përgjigjja e shkurtër
Bluja e metilenit në testimin e G6PD është tregues redoks. Enzima G6PD prodhon NADPH dhe sistemet e varura nga NADPH e reduktojnë blunë e metilenit në formën e saj leuko pa ngjyrë (ose e përdorin për të bartur elektrone). Aktiviteti normal enzimatik mundëson reduktim efikas. Aktiviteti i mangët sjell reduktim të ngadaltë ose të paplotë. Ky është i gjithë sinjali.
Dy metoda historike përdorin të njëjtin ngjyrues, por ndryshojnë në pikën përfundimtare. Dallojini nga njëra-tjetra dhe shumica e paqartësive zhduken.
Dy teste, një ngjyrues, pika përfundimtare të ndryshme
I pari është testi i drejtpërdrejtë i reduktimit të blusë së metilenit, i përshkruar nga Sass dhe kolegët e tij dhe i vlerësuar më vonë nga Gibbs. Këtu pika përfundimtare është vetë ngjyruesi: bluja e metilenit e oksiduar, me ngjyrë blu, reduktohet drejt leukoblusë së metilenit pa ngjyrë dhe shpejtësia e këtij ndryshimi pasqyron kapacitetin për të prodhuar NADPH. Punimi fillestar mbi depistimin është indeksuar në PubMed me autorësi Sass et al. (1966).
I dyti është testi Brewer i reduktimit të methemoglobinës. Nitriti i natriumit fillimisht e oksidon hemoglobinën në methemoglobinë kafe. Më pas, bluja e metilenit vepron si ndërmjetës i transferimit të elektroneve: bluja e metilenit e reduktuar ia kalon ekuivalentët reduktues methemoglobinës, duke e kthyer atë sërish në hemoglobinë të kuqe. Prandaj, pika përfundimtare e dukshme është kafe kundrejt së kuqes, jo blu kundrejt mungesës së ngjyrës. Metoda origjinale u botua në Buletinin e Organizatës Botërore të Shëndetësisë (Brewer et al., 1960).
Ta quash analizën Brewer një test çngjyrosjeje të ngjyruesit është kimikisht e pasaktë. Ngjyruesi kalon nëpër një cikël; hemoglobina ndryshon ngjyrë. Diagrami më poshtë paraqet të dyja rrugët.
Reaksioni bazë
G6PD katalizon hapin e parë oksidues të rrugës së pentozë-fosfatit:
Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
Eritrocitet e pjekura varen shumë nga kjo rrugë për NADPH, siç shpjegohet në artikullin përmbledhës të Luzzatto dhe kolegëve në Blood (2020). NADPH e mban glutationin në gjendje të reduktuar dhe e mbron qelizën nga dëmtimi oksidativ. Bluja e metilenit përfshihet në këtë sistem si pranues elektronesh. Niveli i mjaftueshëm i G6PD siguron NADPH të mjaftueshëm, që mundëson reduktim efikas. Niveli i ulët i G6PD e këput zinxhirin që në hallkën e parë.
Mendojeni ngjyruesin si tregues të karburantit, jo si motor. Ai tregon furnizimin me NADPH. Çdo faktor tjetër që ndryshon këtë furnizim ose leximin e rezultatit mund ta lëvizë treguesin pa asnjë ndryshim në gjen.
Si kryhet procedura e tipit Brewer
Formulimet e reagentëve kanë ndryshuar gjatë dekadave, prandaj një përshkrim mësimor nuk duhet ngatërruar me një protokoll klinik. Çdo laborator ndjek procedurën e vet standarde të punës, të validuar. Duke pasur parasysh këtë rezervë, konfigurimi klasik me epruveta funksionon si më poshtë, në një formë të dokumentuar me tri epruveta dhe inkubim për 3 orë në këtë zbatim të botuar:
- Epruveta e pacientit: gjak i plotë me glukozë, nitrit natriumi dhe blu metileni. Nitriti krijon methemoglobinë, glukoza ushqen metabolizmin e eritrociteve dhe ngjyruesi mundëson bartjen e elektroneve të varur nga NADPH.
- Kontrolli i oksiduar: gjak me nitrit dhe glukozë, por pa blu metileni. Ai tregon pikën përfundimtare kafe të methemoglobinës, modelin e mungesës.
- Kontrolli i hemoglobinës: gjak me ujë. Ai tregon pikën përfundimtare të kuqe të hemoglobinës, modelin normal.
- Inkuboni të gjitha epruvetat afër 37 C, zakonisht për 3 orë, duke i përzier lehtë.
- Holloni një alikuotë të vogël nga çdo epruvetë në ujë të distiluar për të lizuar qelizat dhe për ta bërë të qartë krahasimin e ngjyrave.
- Krahasoni epruvetën e pacientit me dy kontrollet. Rikthimi drejt së kuqes tregon kapacitet të konsiderueshëm reduktues. Ruajtja e ngjyrës kafe sugjeron mungesë të theksuar.
Një formulim historik përdorte rreth 1 mL gjak me reagentë me përqendrime afër 180 mM nitrit natriumi, 280 mM dekstrozë dhe 0.4 mM blu metileni. Trajtojini këto shifra si shembull nga literatura, jo si specifikim universal.
Leximi i rezultatit
| Modeli | Pamja në testin Brewer | Kuptimi |
|---|---|---|
| Normal | Epruveta e pacientit i afrohet kontrollit të kuq të hemoglobinës | Kapacitet reduktues mbi pragun e depistimit |
| Me mungesë | Epruveta e pacientit mbetet kafe, afër kontrollit të methemoglobinës | Depistimi sugjeron mungesë të theksuar të G6PD |
| I ndërmjetëm | Ngjyra është midis dy kontrolleve | Mos përcaktoni fenotip; matni aktivitetin në mënyrë sasiore |
Një test depistues cilësor dallon më mirë rreth 30 deri në 40 për qind të aktivitetit normal, siç diskutohet në këtë artikull përmbledhës të Malaria Journal mbi mangësitë në zbulimin e mungesës së G6PD. Prandaj, një rezultat normal depistimi do të thotë se analiza nuk zbuloi mungesë të rëndë. Ai nuk vërteton aktivitet plotësisht normal.
Pse depistimi mund të jetë çorientues
Retikulocitoza pas hemolizës është rasti klasik i një rezultati normal të rremë. Eritrocitet e reja dhe retikulocitet përmbajnë më shumë G6PD sesa qelizat e vjetra. Gjatë një episodi akut hemolitik, qelizat më të vjetra, me mungesën më të madhe, mund të jenë shkatërruar tashmë, duke lënë një popullatë të re qelizash, aktiviteti i së cilës rezulton normal në testim. I njëjti proces biologjik çorienton edhe analizat sasiore, jo vetëm testet depistuese me ngjyrues.
Transfuzioni i kohëve të fundit e maskon mungesën, sepse eritrocitet e dhuruesit kontribuojnë me enzimën e tyre në mostër. Mayo Clinic Laboratories e rendit transfuzionin ndër shkaqet e rezultateve enzimatike jo të besueshme, krahas retikulocitozës dhe ndërhyrjes nga leukocitet.
Femrat heterozigote janë rasti më i vështirë. Inaktivizimi i rastësishëm i kromozomit X krijon një përzierje eritrocitesh normale dhe me mungesë, dhe aktiviteti i përgjithshëm mund të variojë nga mungesë e rëndë deri në normal në dukje. Testet depistuese cilësore shpesh nuk i zbulojnë fenotipet e ndërmjetme. Dokumentacioni i OBSH-së mbi testimin e G6PD e trajton në hollësi këtë kufizim.
Koha që ka kaluar nga marrja e mostrës, temperatura e ruajtjes, subjektiviteti i vlerësimit vizual të pikës përfundimtare, hematokriti dhe cilësia e reagentëve shtojnë zhurmë analitike mbi këto efekte biologjike.
Depistimi nuk është diagnozë
Një rezultat depistimi që tregon mungesë, është i ndërmjetëm ose nuk përputhet me tablonë klinike kërkon një analizë sasiore të enzimës G6PD. OBSH-ja e konsideron spektrofotometrinë sasiore me temperaturë të kontrolluar si metodën e referencës. Në këtë analizë, një hemolizati eritrocitar i shtohen glukozë-6-fosfat dhe NADP+, dhe NADPH i formuar ndiqet përmes rritjes së absorbancës në 340 nm. Shpejtësia e ndryshimit është proporcionale me aktivitetin enzimatik, zakonisht e normalizuar ndaj hemoglobinës si njësi për gram. Praktika aktuale laboratorike klinike përmblidhet në zërin e katalogut të testeve të Mayo për aktivitetin e G6PD.
Interpretimi përdor intervalin e referencës të validuar nga laboratori, shpesh të përcaktuar në raport me aktivitetin normal në popullatë, ku mungesa zakonisht diskutohet rreth pragut prej 30 për qind dhe aktiviteti i ndërmjetëm mbi të. Profilet e synuara të produkteve të OBSH-së për testet e G6PD (2022) e paraqesin këtë kuadër diagnostik. Nëse hemoliza ose transfuzioni i kohëve të fundit e bën përcaktimin e fenotipit jo të besueshëm, përsëriteni testimin pasi popullata e eritrociteve të jetë ekuilibruar sërish; testimi molekular mund të shtojë informacion pa zëvendësuar matjen e enzimës.
Një dallim që ia vlen të ruhet
Bluja e metilenit në këto analiza është një reagent laboratorik ex vivo. Ky fakt i përket një diskutimi të ndryshëm nga siguria e administrimit të blusë së metilenit te një pacient, e cila trajtohet në udhëzimet mbi kundërindikacionet e blusë së metilenit. Biokimia i lidh të dyja, sepse edhe bari varet nga reduktimi i varur nga NADPH, por një ngjyrues në epruvetë nuk është një dozë në qarkullimin e gjakut. Për kontekst mbi mënyrën se si sillet ngjyruesi gjatë ngjyrosjes në një mjedis tjetër, shihni parimet e ngjyrosjes me blu metileni, ndërsa për familjen kimike së cilës i përket, ngjyruesit redoks në laborator.
Depistimi pyet nëse kapaciteti reduktues duket i ruajtur. Konfirmimi pyet sa enzimë është realisht e pranishme. Ngjyruesi i shërben mirë pyetjes së parë, me kusht që askush të mos i kërkojë t'i përgjigjet së dytës.