Bluja e metilenit në kërkimet me peshkun zebra: shtesë për mirëmbajtjen dhe faktor ngatërrues eksperimental

Uji për vezët e peshkut zebra shpesh ka një nuancë të lehtë blu dhe pothuajse askush nuk e shënon arsyen. Ngjyruesi është bluja e metilenit, e shtuar kundër kërpudhave, dhe shumica e protokolleve e trajtojnë si pjesë të sfondit. Sfondi është koncepti i gabuar këtu. Një koncept më i përshtatshëm është ai i një faktori eksperimental të padeklaruar: diçka që është e pranishme në enët e trajtuara dhe mungon te kontrollet, që është farmakologjikisht aktive në përqendrimet e përdorura dhe që mund të ndryshojë pikërisht treguesit përfundimtarë që mat eksperimenti.

Ky dallim përcakton gjithçka që vijon. Mirëmbajtja rutinë kundër kërpudhave është një çështje. Nëse shtesa është neutrale ndaj testit tuaj është një çështje tjetër. Literatura e kohëve të fundit për peshkun zebra i përgjigjet së parës në mënyrë qetësuese dhe së dytës në mënyrë shqetësuese.

Çfarë përcaktojnë në të vërtetë udhëzimet

Nuk ka një standard të vetëm, dhe kjo është pjesë e problemit. Udhëzimet e Këshillit Kanadez për Kujdesin ndaj Kafshëve lejojnë 0.5 mg/L, ose 0.00005%, në tretësirën për transportimin e vezëve dhe larvave, për të ulur rritjen e kërpudhave. Udhëzimet evropiane për kafshët laboratorike përshkruajnë mbajtjen e embrioneve në një mjedis që shpesh përmban të njëjtin përqendrim prej 0.00005%. Receta E3 e Cold Spring Harbor përcakton dyfishin e kësaj sasie, 1 mg/L ose 0.0001%, si përbërës të recetës. Përballë kësaj qëndron një mungesë e dukshme: udhëzimi i OECD-së për testin e toksicitetit në embrionet e peshqve përcakton ujë hollimi të ripërgatitur dhe substancën kimike që testohet, pa asnjë rekomandim për blunë e metilenit, si në versionin e vitit 2013, ashtu edhe në rishikimin e mëvonshëm. Kështu, një laborator rrit embrionet e peshkut zebra në ujë blu me blu metileni që nga orët e para të jetës, një tjetër kryen testin rregullator me embrione në ujë pa ngjyrë, dhe të dy e quajnë mjedisin e tyre normal. Kushdo që krahason rezultatet mes laboratorëve ose bashkon të dhënat historike të kontrolleve e trashëgon këtë mospërputhje.

Për t’i vendosur përqendrimet në kontekst, 0.00005% është rreth 1.56 micromolar dhe 0.0001% rreth 3.13 micromolar. Këto janë vlera të ulëta dhe është joshëse t’i konsiderosh tepër të ulëta për të pasur rëndësi. Studimet më poshtë testojnë pikërisht këtë supozim, pikërisht në këto përqendrime.

Lexuesit që vijnë nga mbajtja e peshqve dhe jo nga laboratori e ndeshin të njëjtën molekulë në një kontekst tjetër, të trajtuar në udhëzuesin e akuariumit për blunë e metilenit. Kimia është e njëjtë; shpjegimi se si ngjyruesi transporton elektrone brenda qelizave tregon pse një përbërje aktive në reaksionet redoks shfaqet vazhdimisht në artikujt për metabolizmin. Ajo që vijon lidhet posaçërisht me ujin për vezët e peshkut zebra që përmban blu metileni.

Metabolizmi: efekti ndryshon drejtim sipas fazës

Studimi më informues ekspozoi peshq zebra me zhvillim normal që nga dita e parë e jetës deri në 5 ditë pas fekondimit dhe mati metabolizmin oksidativ në çdo fazë, siç përshkruhet në raportin e botuar për eksperimentet mbi metabolizmin e embrioneve. Modeli ia vlen të shpjegohet me kujdes, sepse drejtimi i efektit përmbyset.

Në 1 ditë pas fekondimit, konsumi bazal i oksigjenit u rrit te embrionet e ekspozuara në të dyja përqendrimet e përdorura për mirëmbajtje. Në 2 ditë, potenciali i membranës mitokondriale në shtresën sipërfaqësore të larvave ishte i rritur gjatë ekspozimeve në 0.00005%, 0.0001% dhe 0.0003%. Në 4 deri në 5 ditë, pas çeljes, drejtimi ishte përmbysur: shpenzimi oksidativ i energjisë u ul, pavarësisht nëse ekspozimi kishte qenë i vazhdueshëm që nga fekondimi apo akut vetëm nga dita 3 deri në ditën 4. Paralelisht, transkriptet për nënnjësitë e komplekseve respiratore mitokondriale u pakësuan si në ditën 1, ashtu edhe në ditën 4, së bashku me transkriptet që lidhen me steroidogjenezën dhe glukoneogjenezën.

Dy vëzhgime të tjera e qartësojnë më tej tablonë. Çelja ndodhi pak më herët në përqendrimin më të lartë të përdorur për mirëmbajtje: embrionet e ekspozuara ishin më të përparuara në ditën 2, ndërsa kontrollet i arritën në ditën 3. Gjithashtu, vetë boshti i stresit dukej i paprekur: kur larvat 5-ditëshe iu nënshtruan një stresori rrotullues, kortizoli në të gjithë trupin u rrit normalisht në të dyja grupet. Pra, ngjyruesi nuk është një helm i përgjithshëm për zhvillimin në këto doza dhe nuk i shuan të gjitha përgjigjet fiziologjike. Ai ndryshon metabolizmin energjetik në varësi të fazës, duke e rritur para çeljes dhe duke e ulur pas saj.

Sjellja: pse dy studime nuk përputhen dhe pse të dyja mund të kenë të drejtë

Literatura mbi sjelljen duket kontradiktore derisa skemat e ekspozimit vendosen krah për krah. Një studim i sigurisë për zhvillimin dhe sjelljen ekspozoi embrionet që nga rreth 6 orë pas fekondimit në përqendrime deri në 10 micromolar, i rinovoi tretësirat çdo ditë deri në ditën 4, pastaj i zhvendosi larvat në mjedis pa ngjyrues për ditët 5 dhe 6 dhe testoi aktivitetin lokomotor në një test dritë-errësirë në ditën 6. Rezultati: asnjë efekt domethënës në vdekshmëri, çelje apo morfologji dhe asnjë efekt të trajtimit në aktivitetin lokomotor. Autorët rekomanduan në mënyrë të arsyeshme 10 micromolar si kufi të sipërm në kushtet e tyre.

Një grup i dytë, me disa autorë të përbashkët me studimin e metabolizmit, e realizoi ekspozimin sipas praktikës reale të mirëmbajtjes: ngjyruesi ishte i pranishëm që nga 2 deri në 3 orë pas fekondimit, me rinovim të pjesshëm të përditshëm, dhe sjellja u mat ndërsa ekspozimi vazhdonte ose kishte përfunduar së fundmi. Në të njëjtat përqendrime rutinë, larvat shfaqën aktivitet lokomotor të reduktuar në një test 24-orësh, të riprodhueshëm në linja dhe laboratorë të ndryshëm, dhe studimi mbi ngatërrimin e rezultateve të sjelljes e lidhi efektin me tonusin serotoninergjik, në përputhje me frenimin e njohur të monoaminoksidazës nga ngjyruesi. Më domethënësja ishte se mjedisi për embrionet që përmbante blu metileni maskoi përgjigjen lokomotore të pritshme ndaj fluoksetinës, një SSRI. Prandaj, një test depistimi i kryer në ujë blu mund të mos zbulojë një efekt të barit që do të shfaqej në ujë pa ngjyrë.

Nuk ka ndonjë kundërthënie të vërtetë. Një përbërje mund të mos lërë asnjë efekt të mbetur të dallueshëm dy ditë pas largimit të saj në një test dhe përsëri të jetë aktive kur është e pranishme në një tjetër. Interpretimi praktik është se rezultati pa efekt mbështet një kufi të sipërm përqendrimi, jo një pretendim për neutralitet, ndërsa rezultati me efekt përshkruan rrezikun që ka rëndësi: ekspozimin aktiv gjatë intervalit të matjes, pikërisht në konfigurimin që përdorin shumica e laboratorëve.

Një ngjyrues redoks brenda një testi redoks

Një kurth tjetër meriton paragrafin e vet, sepse shtrembëron instrumentin e matjes dhe jo kafshën. Vetë testi Alamar Blue për shpenzimin e energjisë mbështetet në kiminë redoks: rezazurina reduktohet në rezorufinë fluoreshente. Edhe bluja e metilenit përfshihet në reaksione redoks. Në kontrollet pa qeliza, të dyja përqendrimet e përdorura për mirëmbajtje e ulën lehtë, por në mënyrë domethënëse, fluoreshencën e Alamar Blue pas 24 orësh. Në eksperimentet me kafshë, embrionet e ekspozuara u shpëlanë të paktën tri herë në mjedis pa ngjyrues përpara testit, dhe efekti biologjik te larvat e çelura e tejkaloi ndërhyrjen e vërejtur pa qeliza. Pra, të dyja janë të vërteta: kafshët e shpëlara mbartin një efekt të vërtetë metabolik, ndërsa ngjyruesi i pashpëlar shton mbi të një artefakt kimik të drejtpërdrejtë. Kontrollet duhet t’i ndajnë këto dy efekte, përndryshe asnjëra nga vlerat nuk ka kuptim. Udhëzimet e përgjithshme për interpretimin e rezultateve të testeve të bazuara në ngjyrues kanë këtu një rëndësi veçanërisht të madhe.

Kronologjia e fazave të zhvillimit

Materiali origjinal për këtë artikull. Përqendrimet janë dy vlerat standarde të mirëmbajtjes, 0.00005% dhe 0.0001%, përveç rasteve kur shënohet ndryshe.

Modeli që duhet mbajtur mend është një rritje e hershme dhe një ulje e mëvonshme e treguesve metabolikë, me efekte në sjellje të pranishme gjatë ekspozimit dhe të padallueshme pas eliminimit të ngjyruesit në të vetmin test që e shqyrtoi këtë.

Listë kontrolli për projektimin e kontrolleve

Materiali i dytë origjinal. Përdoreni kur protokollet me blu metileni për peshkun zebra ndërthuren me një eksperiment.

1. Raportojeni ngjyruesin si reagent, jo si ujë. Shënoni përqendrimin si në përqindje, ashtu edhe në micromolar, fillimin dhe përfundimin në orë ose ditë pas fekondimit, planin e rinovimit dhe intervalin e largimit të ngjyruesit para çdo matjeje.
2. Përshtatini kontrollet me pyetjen. Një studim i substancës kimike që testohet kërkon kontrolle pa ngjyrues; një studim i mirëmbajtjes kërkon grupe pa ngjyrues kundrejt grupeve me ngjyrues, me regjistrim të rezultatit kundër kërpudhave, pasi asnjëri nga studimet e cituara nuk mati efikasitetin kundër kërpudhave.
3. Shpëlani para testeve redoks, pastaj verifikoni. Shpëlani të paktën tri herë në mjedis pa ngjyrues dhe kryeni paralelisht një kontroll pa qeliza me ngjyrues dhe reagent, sepse ngjyruesi e ul drejtpërdrejt sinjalin e Alamar Blue.
4. Trajtojini treguesit e sjelljes dhe të monoaminave si tregues me rrezik të lartë. Studimet e aktivitetit lokomotor, reagimit të trembjes, sjelljeve të ngjashme me ankthin, antidepresantëve dhe frenuesve të MAO-së duhet ta shmangin ngjyruesin gjatë matjes ose të demonstrojnë neutralitet për treguesin përkatës; një deri në dy ditë largimi të ngjyruesit eliminuan një efekt lokomotor, por kjo nuk është vërtetuar për skema të tjera eksperimentale.
5. Trajtojini treguesit metabolikë dhe mitokondrialë si tregues me rrezik të lartë në çdo fazë. Konsumi i oksigjenit, shpenzimi i energjisë, potenciali i membranës dhe transkriptet e zinxhirit respirator ndryshojnë në përqendrimet e përdorura për mirëmbajtje, në drejtime të kundërta para dhe pas çeljes.
6. Mos e përgjithësoni neutralitetin nga një skemë eksperimentale te tjetra. Një rezultat pa efekt pas largimit të ngjyruesit nuk vlen për ekspozimin që vazhdon; një rezultat morfologjik pa efekt nuk vlen për metabolizmin apo ndërveprimin me barnat; një rezultat në një linjë, temperaturë ose kohëzgjatje testi nuk vlen për të tjerat.
7. Deklaroni udhëzimin që keni ndjekur dhe alternativën e tij. Përmendni shprehimisht përqendrimet e CCAC-së, të udhëzimeve evropiane ose të Cold Spring Harbor dhe shënoni se ku testi i OECD-së me embrione nuk e përfshin ngjyruesin, në mënyrë që lexuesi të kuptojë kushtet në të cilat janë mbajtur kafshët tuaja.

Asgjë nga kjo nuk është argument kundër përdorimit të ngjyruesit për t’i mbajtur vezët gjallë. Është argument kundër lejimit që një zgjedhje mirëmbajtjeje të ndikojë në të dhëna pa u shqyrtuar. Bluja në enë është një molekulë me farmakologjinë e vet, dhe eksperimentet që kanë më shumë gjasa të shtrembërohen janë pikërisht testet metabolike dhe neurobihejviorale me kapacitet të lartë përpunimi, për të cilat tashmë parapëlqehen peshqit zebra në fazat e hershme të jetës. Regjistrojeni, kontrollojeni, largojeni para se të matni dhe verifikoni testin në të cilin mund të jetë duke marrë pjesë pa u vënë re.