Kërkimet antimikrobike dhe antifungale mbi blunë e metilenit: drita kundrejt errësirës

Dy lexues shohin shprehjen «blu metileni antimikrobike» dhe përfytyrojnë gjëra të ndryshme. Njëri përfytyron një lëng blu që helmon mikrobet në kontakt. Tjetri përfytyron një procedurë ku ngjyruesi bashkë me dritën e kuqe i shkatërron ato. Të dyja përfytyrimet përmbajnë një pjesë të së vërtetës. Asnjëri nuk është një koncept i plotë dhe pikërisht ngatërrimi i tyre është pika ku shumica e pretendimeve në internet gabojnë.

Ky dallim është tema e këtij shqyrtimi. Bluja e metilenit ka toksicitet modest në errësirë, në përqendrim të mjaftueshëm. Me dritë të kuqe, ajo bëhet fotosensibilizues: përthith një foton, arrin një gjendje reaktive triplete dhe nxit reaksione oksiduese që dëmtojnë shumë objektiva njëherësh. Ky regjim i aktivizuar nga drita ka emrin e vet, terapi fotodinamike antimikrobike, dhe kushtet e veta. Përqendrimi i vetëm nuk e përcakton. Gjatësia e valës, doza e dritës, inkubimi, oksigjeni dhe organizmi përcaktojnë rezultatin.

Dy konceptet e vrasjes

Mendoni fillimisht për konceptin në errësirë. Bluja e metilenit është një ngjyrues fenotiazinik me ngarkesë pozitive. Ajo lidhet me mbështjellëset mikrobike, hyn në qeliza në shkallë të ndryshme dhe merr pjesë në reaksione redoks dhe lidhjeje. Nuk përfshihen fotone. Vrasja ndodh, por vetëm në përqendrime që ndryshojnë shumë sipas organizmit, dhe mekanizmi nuk mbështetet te një objektiv i vetëm i qartë.

Koncepti fotodinamik shton dritën. Fotonet e kuqe rreth 630 deri në 680 nm përputhen me brezin e përthithjes së ngjyruesit, me kulmin e monomerit pranë 664 nm. Përthithja e çon ngjyruesin në një gjendje singlete jetëshkurtër, pastaj në një gjendje triplete më jetëgjatë. Prej aty vijojnë dy grupe reaksionesh. Në reaksionet e Tipit I, gjendja triplete transferon një elektron te një substrat dhe nis rrugë reaksionesh radikalore që përfshijnë superoksidin dhe speciet hidroksile. Në reaksionet e Tipit II, ajo transferon energji drejtpërdrejt tek oksigjeni në gjendjen bazë dhe prodhon oksigjen singlet. Të dyja mund të zhvillohen njëherësh, dhe ta quash ngjyruesin një agjent të pastër të oksigjenit singlet është tepër thjeshtuese. Një shqyrtim i marrëdhënies strukturë–aktivitet të fotosensibilizuesve fenotiazinikë e tregon drejtpërdrejt këtë pikë: te ngjyruesit e afërt, fototoksiciteti ndaj baktereve nuk ndiqte vetëm rendimentin e oksigjenit singlet, sepse përthithja qelizore, lokalizimi dhe reduktimi në formën leuko joaktive kishin po aq rëndësi sa fotofizika. Fotokimia pas rregullit të gjatësisë së valës shpjegohet në shqyrtimin shoqërues të ngjyruesit bashkë me dritën e kuqe.

Oksigjeni singlet është thelbësor për një veti të dobishme. Ai reagon me shumë biomolekula njëherësh, ndaj sulmi është shumëfaktorial dhe jo i drejtuar ndaj një enzime të vetme ose proteine lidhëse. Një përshkrim themelor i kimioterapisë antimikrobike fotodinamike e paraqiti këtë si arsyen pse profilet konvencionale të rezistencës kanë pak peshë: një proteinë shtesë që lidh penicilinën ose një topoizomerazë e mutuar nuk e bllokon një vrull të oksigjenit reaktiv. Kjo logjikë u vërtetua në testimet kundër Staphylococcus aureus rezistent ndaj meticilinës dhe enterokokëve rezistentë ndaj vankomicinës, siç tregon matrica më poshtë. Kjo nuk do të thotë se rezistenca është e pamundur, por vetëm se ajo funksionon ndryshe. Pompat e efluksit dhe mbrojtjet antioksiduese mund ta ndryshojnë ende dozën e nevojshme, veçanërisht te kërpudhat.

Matrica e organizmave dhe modeleve të studimit

Kjo tabelë është elementi kryesor i artikullit. Çdo vlerë është specifike për protokollin: i njëjti ngjyrues, por dozë drite ose inkubim i ndryshëm, jep një numër tjetër. Mos i lexoni MBC, MLC dhe MIC si të këmbyeshme. MBC dhe MLC këtu nënkuptojnë se nuk ka të mbijetuar në nënkulturë, ndërsa MIC nënkupton frenim të rritjes. Kushtet e ndriçimit shoqërojnë çdo zë.

Organizmi dhe modeli	Rezultati në errësirë	Rezultati me dritë	Kushtet
S. aureus NCTC 6571, pezulli planktonike	MBC 5 uM	MBC 5 uM	Tabela e shqyrtimit, dritë e bardhë 12 J per cm2
S. aureus NCTC 6571, pezulli planktonike	MLC 2.5 uM	MLC 1 uM	Protokolli parësor i vitit 1997, 1.7 mW per cm2 për 1 orë, rreth 6.3 J per cm2, inokulum afër 10^6 CFU per mL, raportuar në studimin origjinal të veprimit fotobaktericid të ngjyruesve fenotiazinikë
MRSA EMRSA-15, planktonik	MBC 80 uM	MBC 20 uM	Tabela e shqyrtimit, rreth 12 J per cm2, sensibilizim katërfish
MRSA EMRSA-16, planktonik	MBC 40 uM	MBC 10 uM	I njëjti protokoll si më sipër
E. coli NCTC 9001, planktonik	MBC 500 uM	MBC 100 uM	I njëjti protokoll, sensibilizim pesëfish
P. aeruginosa NCTC 10622, planktonik	MBC 500 uM	MBC 25 uM	I njëjti protokoll, sensibilizim njëzetfish
E. faecalis NCTC 775, planktonik	MLC 100 uM	MLC 100 uM	Protokolli i vitit 1997 me 6.3 J per cm2, pa përmirësim për këtë shtam dhe dozë
E. faecium rezistent ndaj vankomicinës, planktonik	MBC 400 uM	MBC 400 uM	Tabela e shqyrtimit, pa përmirësim me ngjyruesin bazë, ndërsa derivatet e metiluara më hidrofobe sollën përmirësim, sipas studimit mbi enterokokun rezistent ndaj vankomicinës
Candida albicans, planktonike	MIC mbi 12.79 ug per mL	MIC 12.79, 6.39 dhe 1.59 ug per mL në 5, 10 dhe 15 J per cm2	Parainkubim 30-minutësh në errësirë, LED i kuq 600 deri në 650 nm me kulm në 635 nm, sipas një studimi dozë–përgjigje të veprimit fotodinamik antifungal të blusë së metilenit
C. albicans YEM14 kundrejt shtamit me mbishprehje të pompave të efluksit, vrasje e matur me CFU	Nuk zbatohet	Rreth 5 log vrasje te shtami bazë, vrasje afër zeros te shtami me mbishprehje të CDR1/CDR2	100 uM ngjyrues, inkubim 30-minutësh, 660 nm me 60 J per cm2, sipas një studimi të efekteve të pompave të efluksit mbi vrasjen fotodinamike me blu metileni
Hifet kundrejt sporeve të Trichophyton rubrum	Nuk zbatohet	MIC e hifeve rreth 6.3 ug per mL, e sporeve rreth 2.0 ug per mL; bllokimi i plotë i CFU kërkonte 5 ug per mL plus 100 J per cm2 për hifet kundrejt 1.25 ug per mL plus 40 J per cm2 për sporet	Protokoll fotodinamik me 635 nm, sipas një studimi të ndjeshmërisë sipas fazës së zhvillimit të dermatofiteve
Biofilm subgingival i maturuar me 33 specie, pajisja Calgary, dita 6	Vetëm MB, ulje mbi 80 për qind e numrit total	MB plus LED 660 nm, ulje rreth 55 për qind e aktivitetit metabolik, pa ristrukturim të gjerë të bashkësisë	0.01 për qind ngjyrues (100 ug per mL), 660 nm me rreth 330 mW per cm2 për 5 minuta, rritje anaerobe, sipas një studimi in vitro të biofilmit oral me shumë specie

Dallohen tri prirje. Së pari, stafilokokët Gram-pozitivë vdesin në nivele të ulëta mikromolare, ndërsa bakteret në formë shkopi Gram-negative kanë nevojë për afërsisht njëqind herë më shumë ngjyrues në errësirë, sepse membrana e jashtme e Gram-negativëve kufizon hyrjen. Drita e ngushton hendekun, por nuk e mbyll. Së dyti, veprimi antifungal i blusë së metilenit është real, por i kushtëzuar: vrasja antifungale e Candida nga bluja e metilenit përmirësohet ndjeshëm me dozën e dritës, dhe një ndryshim i vetëm fenotipik, si mbishprehja e pompave të efluksit, mund ta zhdukë një vrasje prej 5 log me dozë identike. Së treti, biofilmi i maturuar sillet ndryshe nga pezullitë, dhe në këtë kontekst duhet lexuar rreshti për biofilmin oral.

Bakteret: ku ndihmon më shumë drita dhe ku jo

Stafilokokët janë rasti i ndjeshëm. Edhe vlerat e tabelës së shqyrtimit për MRSA epidemike janë të barabarta me ose më të ulëta se ato të vankomicinës krahasuese kur aplikohet drita, dhe derivatet e dimetiluara dolën edhe më mirë, sepse metilimi rriti lipofilicitetin dhe rendimentin e oksigjenit singlet, duke i rezistuar njëkohësisht reduktimit në formën leuko. Ky hollësi kimike ka rëndësi: tregon se vrasja është produkt i shpërndarjes së ngjyruesit dhe i fotofizikës së bashku, jo vetëm i fotofizikës.

Organizmat Gram-negativë ilustrojnë pjesën e shpërndarjes. Pseudomonas kërkonte 500 uM në errësirë dhe 25 uM me dritë, një përmirësim njëzetfish, megjithatë vlera me ndriçim mbetet shumë mbi intervalin e stafilokokëve. Ngarkesa kationike e ndihmon ngjyruesin t'i afrohet membranës së jashtme, por depërtimi mbetet faktori kufizues. Formulimet, koha e inkubimit dhe zgjedhja e derivatit i ndryshojnë këto numra më shumë sesa përsëritja e të njëjtit ngjyrues në dozë më të lartë.

Enterokokët shërbejnë si paralajmërim. Sipas protokolleve më të vjetra, E. faecalis nuk tregoi asnjë përparësi nga drita, dhe E. faecium rezistent ndaj vankomicinës kërkonte një molekulë tjetër, jo më shumë dritë. Kushdo që citon një MBC të vetme të blusë së metilenit si një konstante të përgjithshme antibakteriale po e lexon gabim literaturën. Një konstante e tillë nuk ekziston. Ka vetëm vlera specifike për shtamin, mjedisin, inokulumin, inkubimin, gjatësinë e valës dhe fluencën. Mënyra si t'i lexoni këto vlera pa mashtruar veten trajtohet në udhëzuesin për interpretimin e kurbave të vrasjes.

Kërpudhat: të ndjeshme, por vendosin faza dhe pompat

Muret kërpudhore prej glukanesh, mananesh dhe kitine paraqesin një problem përthithjeje të ndryshëm nga ai i baktereve, dhe kërpudhat shtojnë mbrojtje aktive. Rezultati i efluksit te Candida më sipër është shembulli më i qartë: ngjyrues identik, dritë identike, mjedis identik, megjithatë shtami me mbishprehje mbijetoi, ndërsa shtami bazë humbi rreth 99.999 për qind të njësive formuese të kolonive. Dermatofitet shtojnë një dimension zhvillimor. Sporet vdesin shumë më lehtë se hifet, ndaj një protokoll që eliminon sporet mund të lërë ende fragmente hifesh të gjalla me të njëjtën dozë.

Prandaj, raportet antifungale për blunë e metilenit kërkojnë të njëjtin rigorozitet lidhur me dritën si raportet bakteriale. Studimet klinike fotodinamike për thonjtë dhe lëkurën kombinuan ngjyrues 1 deri në 2 për qind me dritë të kuqe të matur, në fluenca të përcaktuara dhe me ndjekje pas trajtimit, dhe e dalluan pamjen klinike nga eliminimi mikologjik. Këto prova shqyrtohen në përmbledhjen e provave fotodinamike për kërpudhat e thonjve dhe të lëkurës. Lyerja e një lezioni me ngjyrues të holluar nën dritën e dhomës riprodhon ngjyrën, por lë jashtë procedurën.

Verifikimi me biofilm: një model oral me 33 specie

Studimi i vitit 2024 mbi biofilmin oral me shumë specie meriton vëmendje sepse teston rastin e vështirë, jo të lehtin. Tridhjetë e tri specie orale, përfshirë Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium dhe streptokokët oralë, u rritën në kushte anaerobe duke formuar një biofilm të maturuar në ditën 6. Trajtimi ishte ngjyrues 0.01 për qind me LED 660 nm për 5 minuta, me irradiancë të lartë. Si ngjyruesi i vetëm, ashtu edhe drita e vetme, e ulën ndjeshëm numrin total, dhe kombinimi e uli aktivitetin metabolik afërsisht përgjysmë, megjithatë bashkësia nuk u ristrukturua dhe biofilmi nuk u sterilizua.

Ky është një efekt real me një kufi të paraqitur ndershmërisht. Ai mbështet trajtimin fotodinamik si plotësues lokal në një xhep të pastruar, jo si shpëlarës që trajton vetë periodontitin e diagnostikuar. Kjo na çon te hendeku i përgjithshëm.

Pse vrasja në laborator nuk është e barabartë me trajtimin

Një MBC planktonike ekspozon qeliza uniforme ndaj ngjyruesit uniform dhe dritës uniforme në mjedis të oksigjenuar. Një lezion nuk ofron asnjërën prej këtyre. Matrica e ngadalëson hyrjen, gjendjet e ngjashme me ato të qelizave persistente e tolerojnë oksidimin, gjaku dhe eksudati e përthithin dritën, gjeometria e indit lë zona në hije, dhe xhepat hipoksikë i dobësojnë reaksionet e Tipit II, sepse oksigjeni singlet, sipas përkufizimit, kërkon oksigjen molekular. Infeksionet e përziera shtojnë specie që ndryshojnë në përthithje dhe ndjeshmëri, ndaj vlera e një shtami të vetëm referencë nuk mund të përfaqësojë vendin e prekur.

Shembulli oral e bën hendekun konkret. Pakësimi i Porphyromonas ose i streptokokëve në një pjatë laboratorike, ose përgjysmimi i një biofilmi të kultivuar, nuk vërteton se një shpëlarës blu trajton periodontitin, shëron një infeksion endodontik ose eliminon baktereminë. Kujdesi klinik periodontal varet nga prishja mekanike dhe largimi i biofilmit, bashkë me menaxhimin e anatomisë së xhepit, ndërsa trajtimi me bazë drite studiohet si plotësues i lokalizuar. Përqendrimi i ngjyruesit që vret në një pus laboratorik nuk ka marrëdhënie fikse me përqendrimin që arrin te bakteret nën vijën e mishrave të dhëmbëve, dhe drita e dhomës nuk është një dozë 660 nm. Dozimi, siguria dhe kufijtë e ndërveprimeve për çdo përdorim oral janë çështje për një klinicist, siç përshkruhet në referencën për sigurinë dhe ndërveprimet.

Çfarë nuk përfaqësojnë këto prova

Ato nuk përbëjnë një pretendim për dezinfektim shtëpiak. Tabelat baktericide përdorin shtame, mjedise, kohë kontakti, spektre dhe fluenca të përcaktuara. Ato nuk thonë asgjë për sipërfaqet e kuzhinës, kohët e nevojshme të kontaktit në ndotje organike ose standardet rregullatore të dezinfektimit.

Nuk përbëjnë as një zëvendësim të antibiotikëve sistemikë. Veprimi fotodinamik konvencional kërkon ngjyrues, dritë të përthithur dhe oksigjen në të njëjtin vend dhe në të njëjtën kohë. Drita nuk arrin në vatra të thella ose të përhapura ashtu si një bar i gëlltitur arrin në gjak. Literatura e pozicionon këtë qasje për infeksione lokale të arritshme ose si plotësuese, pikërisht siç e paraqiti Wainwright dezinfektimin lokal që në fillim.

Përmbledhja e paanshme është më e kufizuar, por mbetet interesante. Bluja e metilenit ka aktivitet antimikrobik modest në errësirë, dhe drita e kuqe çliron një efekt fotodinamik shumë më të madh për shumë baktere dhe kërpudha, me dallime të mëdha midis dritës dhe errësirës, si 500 në 25 uM për Pseudomonas dhe 80 në 20 uM për MRSA epidemike, krahas dështimeve domethënëse te enterokokët dhe Candida me efluks funksional. Zbatimi praktik përcaktohet po aq nga shpërndarja e ngjyruesit, fiziologjia e biofilmit dhe oksigjeni sa nga përqendrimi nominal i ngjyruesit. Mbajini të dukshme këto kushte dhe numrat kanë kuptim. Hiqini ato dhe numrat nuk kanë asnjë kuptim.