Testet e majasë me blu metileni: numërimi i qelizave të gjalla kundrejt matjes së kohës së frymëmarrjes

Dy epruveta qëndrojnë mbi tavolinën e laboratorit. Të dyja janë blu. Në njërën, qelizat blu nën mikroskop tregojnë maja të vdekura. Në tjetrën, një epruvetë që kalon nga blu në pa ngjyrë tregon se majaja është e gjallë dhe kryen frymëmarrje. I njëjti ngjyrues, interpretime të kundërta. Ngatërroni dy testet dhe çdo përfundim përmbyset.

Ky dallim është thelbi i gjithë artikullit. Bluja e metilenit është një ngjyrues redoks: në gjendje të oksiduar është blu, ndërsa në gjendje të reduktuar është leukoblu metileni pa ngjyrë. Numërimi i viabilitetit e shfrytëzon këtë kimi në një vëzhgim të shkurtër mikroskopik. Eksperimenti i frymëmarrjes e shfrytëzon në një reaksion në të gjithë përzierjen, të matur në kohë. Secili kërkon protokollin e vet, kontrollet e veta dhe skepticizmin e vet.

Numërimi i viabilitetit: ngjyrosje e shkurtër, vlerësim pa vonesë

Protokolli i përdorur në prodhimin e birrës është varianti më i standardizuar. Përgatitni blu metileni 0.01% w/v në citrat natriumi 2%, përziejeni 1:1 me suspensionin e majasë dhe ekzaminoni përzierjen pas një intervali të shkurtër e të përcaktuar. Intervalet e publikuara ndryshojnë nga 1 deri në 2 minuta në manualin e Brewing Science Institute deri në rreth 5 minuta në protokollet kërkimore, ndërsa metoda e OIV për mikrobiologjinë e verës kërkon ekzaminim brenda 10 minutave. Përqendrimi i ngjyruesit në përzierjen për numërim arrin afërsisht 0.005%. Mbushni një dhomë të përmirësuar Neubauer dhe, në zmadhim rreth 400x, klasifikoni qelizat blu të errëta si jo të gjalla dhe qelizat e pangjyrosura si të gjalla. Qelizat blu të çelëta vlerësohen si të gjalla në metodën e OIV, çka paralajmëron që tani problemin e subjektivitetit të diskutuar më poshtë.

Përqendrimi qelizor llogaritet nga gjeometria e dhomës. Kur numërohet i gjithë katrori qendror 1 mm, qelizat për mL janë të barabarta me N shumëzuar me faktorin e hollimit dhe me 10^4, ku N është numri i qelizave në atë sipërfaqe, siç përcaktohet në metodat e ASBC për majanë. Viabiliteti llogaritet më thjesht: qelizat e pangjyrosura pjesëtuar me numrin e përgjithshëm të qelizave, shumëzuar me 100. Numëroni rreth 400 qeliza për një vlerësim të viabilitetit, duke ndjekur studimin krahasues të FEMS për prodhimin e birrës dhe praktikën e OIV. Zbatoni vazhdimisht të njëjtin rregull kufijsh, për shembull duke përfshirë qelizat mbi vijat e poshtme dhe të majta të rrjetës dhe duke përjashtuar ato mbi vijat e sipërme dhe të djathta.

Sythat kërkojnë një rregull përpara se të fillojë numërimi. Një praktikë e zakonshme e numëron sythin si qelizë më vete kur arrin afërsisht gjysmën e madhësisë së qelizës mëmë; nën atë madhësi, numërohet bashkë me qelizën mëmë. Cilindo rregull të zgjidhni, zbatojeni në çdo katror dhe shënojeni në fletën e punës që personi tjetër ta përsërisë.

Fleta e numërimit (shtypeni)

Kjo fletë pune është një material origjinal për këtë artikull. Kopjojeni në një fletore ose shtypni nga një për çdo mostër.

Viabiliteti (%) = 100 x të pangjyrosura / (të pangjyrosura + blu të errëta). Numri i përgjithshëm i qelizave për mL = N x faktori i hollimit x 10^4, ku N merret nga sipërfaqja e përcaktuar e dhomës. Shënoni intervalin e ngjyrosjes pranë rezultatit, sepse një vlerë viabiliteti pa kohën përkatëse nuk është e riprodhueshme.

Pse ndryshojnë vlerat e viabilitetit

Koha është faktori i parë ndërhyrës dhe ndikon në të dyja drejtimet. Qelizat metabolikisht aktive e reduktojnë ngjyruesin, ndaj një vlerësim i hershëm mund t'i kapë qelizat e gjalla përpara se ta kenë përfunduar reduktimin dhe t'i klasifikojë gabimisht si të vdekura. Por ekspozimi i zgjatur është vetë toksik dhe krijon qeliza blu vërtet të dëmtuara, duke dhënë sinjale të rreme vdekjeje nga ngjyrosja. Prandaj, një protokoll mësimor laboratorik përcakton vlerësimin brenda 5 minutave, siç dokumentohet në një protokoll mësimor për majanë nga Wisconsin. Formulimi i kujdesshëm është se vlerësimi me blu metileni varet nga koha, prandaj caktoni një interval të shkurtër dhe mbajeni të pandryshuar për çdo mostër të një serie.

Mostrat me viabilitet të ulët mbartin një burim të dytë shtrembërimi. Metoda e standardizuar paralajmëron se bluja e metilenit mund ta mbivlerësojë viabilitetin e vërtetë nën afërsisht 80%, sepse qelizat që ende e reduktojnë ngjyruesin nuk e ruajnë domosdoshmërisht aftësinë riprodhuese. Literatura për prodhimin e birrës përshkruan të njëjtën mungesë besueshmërie kur viabiliteti është përkeqësuar ndjeshëm. Trajtojeni blunë e metilenit si një vlerësim të shpejtë dhe të përafërt, dhe konfirmoni vendimet kritike në kushte viabiliteti të ulët, si ripërdorimi i një kulture për inokulim, me numërime në pllaka ose me një ngjyrosje plotësuese.

Efektet e matricës vijnë të tretat. Metoda e OIV kryhet afër pH 4.6 dhe paralajmëron se mostrat me pH të ulët dhe kapacitet të fortë tamponues pengojnë sjelljen e duhur të ngjyruesit, ndërsa këshillon të mos përdoret testi mbi 100 g/L sheqer, ku qelizat duken blu të çelëta në mënyrë çorientuese. Një krahasim eksperimental i pH-së së ngjyrosjes gjeti ndryshime të konsiderueshme të ndjeshmërisë përgjatë intervalit të testuar, në përputhje me një studim të metodës me blu metileni të varur nga pH-ja. Mbetjet janë një kurth më vete: grimcat e ngjyrosura në përzierjet e papastra të drithërave ngjajnë me qeliza të vdekura dhe rrisin ndryshueshmërinë midis operatorëve.

Kjo ndryshueshmëri është e matur, jo thjesht e raportuar nga përvoja. Në një provë gjashtëmujore në një fabrikë birre, të raportuar në krahasimin e majasë nga FEMS, matjet e dyfishta me blu metileni kishin mesatarisht devijim standard 6.1%, kundrejt 0.2% për citometrinë në rrjedhë me oksonol, ndërsa dy operatorë dallonin deri në 13 pikë përqindjeje për të njëjtën mostër. Një krahasim sasior i metodave të viabilitetit i vitit 2023 gjeti se mikroskopia me fluoreshencë dhe citometria në rrjedhë ishin dukshëm më të sakta, duke treguar gjithashtu se performanca varet nga lloji dhe matrica. Përshkrimi klasik i metodës nga Painting dhe Kirsop (PMID 24430080) mbetet pikë referimi, ndërsa një rishikim më i gjerë i testeve të viabilitetit dhe vitalitetit të majasë (PMID 25154541) e vendos blunë e metilenit mes testeve plotësuese, jo atyre përfundimtare. Bluja e tripanit nuk është automatikisht një përmirësim këtu: ajo tregon humbjen e integritetit të membranës, ndërsa bluja e metilenit tregon marrjen e ngjyruesit së bashku me aktivitetin reduktues, ndaj qelizat nën stres mund të klasifikohen ndryshe me këta dy ngjyrues.

Eksperimenti i frymëmarrjes: matni kohën e zhdukjes së ngjyrës blu

Testi i dytë nuk përdor fare mikroskop. Majaja, glukoza dhe bluja e metilenit e holluar vendosen në një epruvetë të mbyllur, dhe matet koha që duhet për t'u zhdukur ngjyra blu. Gjatë metabolizmit, qelizat prodhojnë ekuivalentë reduktues që e shndërrojnë ngjyruesin blu në formën e tij pa ngjyrë, ndërsa oksigjeni i tretur e rioksidon. Pasi qelizat e ulin nivelin e oksigjenit, mbizotëron reduktimi neto dhe epruveta çngjyroset. Prandaj, pika përfundimtare pasqyron ekuilibrin midis frymëmarrjes, përqendrimit të ngjyruesit dhe disponueshmërisë së oksigjenit, dhe duhet raportuar si koha e reduktimit ose çngjyrosjes së blusë së metilenit, jo si një shpejtësi e drejtpërdrejtë e konsumimit të oksigjenit molekular.

Përdorni një ngjyrues shumë më të holluar sesa në matjet e viabilitetit, që koha e matjes të bjerë në një interval praktik. Manuali i AQA për punët praktike të detyrueshme të nivelit A e standardizon mirë këtë: 1 g glukozë për 100 mL ujë të ngrohur në rreth 30 C, 5 g maja të tharë të shtuar menjëherë përpara përdorimit dhe një tretësirë pune të ngjyruesit afër 0.001%, të përgatitur duke holluar 0.1 mL të një tretësire bazë 1% deri në 100 mL. Përzieni 2 mL suspension maja-glukozë me 2 mL tretësirë pune të ngjyruesit, lëreni të arrijë temperaturën e testit, tundeni një herë për 10 sekonda, nisni kronometrin dhe mos e tundni më. Tundja rifut oksigjen dhe e bën epruvetën sërish blu, duke përbërë artefaktin më të madh procedural. AQA vëren se përgatitja normalisht duhet të çngjyroset brenda rreth 5 minutave në 35 C, me mesatare të provave prej 275 s në 20 C, 128 s në 35 C dhe 145 s në 45 C. Këto janë shembuj nga një konfigurim i vetëm, jo vlera referimi universale. Lidhja sasiore midis shpejtësisë së reduktimit dhe majasë metabolikisht aktive në kushte të kontrolluara mbështetet nga studime të posaçme të reduktimit, përfshirë punimin e indeksuar si PMID 25773544 dhe studimin mekanistik në Yeast (2014).

Demonstrim i ecurisë kohore (material origjinal)

Tabela më poshtë është një demonstrim origjinal i përgatitur për këtë artikull me konfigurimin e tipit AQA të përshkruar më sipër: 2 mL përzierje maja-glukozë plus 2 mL tretësirë pune të ngjyruesit afër 0.001%, një tundje për 10 sekonda, pastaj inkubim pa e trazuar. Shënimet janë vlera shembull në formatin që duhet të regjistrojë një grup studentësh, me indeksin e shpejtësisë të përcaktuar si 1 pjesëtuar me kohën e çngjyrosjes në sekonda. Kryeni eksperimentin me të njëjtat epruveta dhe zëvendësojini këto shënime me vlera të matura.

Paraqitni në grafik indeksin e shpejtësisë në varësi të temperaturës për epruvetat A, B dhe C. Kurba ngrihet, pastaj sheshohet ose zbret, çka është forma e pritshme për një proces të nxitur nga enzimat, jo një vijë e drejtë. Epruvetat D, E dhe F nuk janë pika të dhënash në atë kurbë. Ato janë kontrollet që e bëjnë kurbën të interpretueshme.

Kontrollet që i japin kuptim secilit test

Çdo eksperiment frymëmarrjeje kërkon tri prova shoqëruese. Majaja e zier ose e vrarë, së bashku me glukozën dhe ngjyruesin, duhet të mbetet blu, duke treguar se reduktimi i shpejtë varet nga metabolizmi i gjallë. Majaja e gjallë me ngjyrues, pa glukozë të shtuar, është një kontroll i substratit, por gjithsesi prisni çngjyrosje të ngadaltë, sepse majaja konsumon rezervat endogjene. Glukoza me ngjyrues pa maja është prova boshe kimike, e domosdoshme sepse glukoza në mjedis alkalin mund ta reduktojë blunë e metilenit edhe pa praninë e qelizave.

Numërimi i viabilitetit kërkon një lloj tjetër kontrolli: pandryshueshmërinë procedurale. E njëjta tretësirë bazë e ngjyruesit, i njëjti raport përzierjeje, i njëjti interval ngjyrosjeje, e njëjta sipërfaqe e dhomës, të njëjtat rregulla për sythat dhe kufijtë, me numërim pa dijeni për identitetin e mostrës kur është e mundur. Kur dy operatorë ndryshojnë me dhjetë pikë, fleta e punës zakonisht zbulon shkakun: kohë të ndryshme, pragje të ndryshme për ngjyrën blu ose rregulla të ndryshme për sythat. Teknikat për përgatitjen dhe vëzhgimin e qelizave të ngjyrosura lidhen me metodat e ngjyrosjes së thjeshtë bakteriale, ndërsa një përmbledhje më e gjerë e strukturave që shënon ngjyruesi në mostra të ndryshme gjendet në atlasin e ngjyrosjes për mikroskopi. Për fizikën që qëndron pas matjes sasiore të çdo intensiteti blu, referenca e absorbimit me kushtet e shënuara shpjegon pse çdo koeficient duhet të shoqërohet me kushtet përkatëse të tretësit, pH-së dhe përqendrimit.

Zgjidheni testin sipas pyetjes. Sa qeliza janë të gjalla tani është një pyetje numërimi, së cilës i përgjigjeni në mikroskop me një fletë pune. Sa aktivisht kryen frymëmarrje kjo kulturë është një pyetje kinetike, së cilës i përgjigjeni me kronometër dhe epruveta të kontrolluara. Bluja e metilenit shërben për të dyja, por kurrë në të njëjtën epruvetë në të njëjtën kohë.