Bluja e metilenit për ngjyrosjen e ADN-së dhe ARN-së: përdorime në xhele dhe membrana

Një student kryen elektroforezën në një xhel agaroze, e ngjyros me blu metileni dhe nuk sheh asgjë aty ku priste një brez të qartë. Në hapësirën ngjitur të punës, një studiues postdoktoral ngjyros një membranë Northern me të njëjtën shishe blu dhe përfton breza ribozomalë të qartë brenda tre minutash. Studenti arrin në përfundimin se xheli dështoi. Xheli nuk dështoi. Dy detyrat ishin të ndryshme dhe i njëjti ngjyrues u përgjigjet atyre me ndjeshmëri të ndryshme, sfond të ndryshëm dhe rregulla të ndryshme për hapat që vijojnë.

Ngjyrosja e ADN-së dhe ngjyrosja e ARN-së me blu metileni kanë të njëjtën kimi, por jo të njëjtin qëllim. Në një xhel, ngjyruesi tregon sa acid nukleik ndodhet brenda një matrice poroze. Në një membranë, ai tregon nëse transferimi funksionoi dhe nëse korsitë u ngarkuan në mënyrë të barabartë. Pasi ky dallim bëhet i qartë, protokollet, kufijtë e zbulimit dhe kufijtë e përputhshmërisë marrin kuptim.

Përgjigjja e shkurtër

Bluja e metilenit është një ngjyrues kationik planar që lidhet me acidet nukleike në mënyrë jokovalente dhe të kthyeshme, përmes një ndërthurjeje të tërheqjes elektrostatike ndaj fosfatit, interkalimit midis çifteve të bazave dhe lidhjes në brazdën e vogël. Pikërisht kjo kthyeshmëri është thelbi. Brezat mund të ngjyrosen, të shihen me dritë të dukshme, të dokumentohen dhe më pas të çngjyrosen ose të pastrohen për klonim, hibridizim apo risondim.

Për ngjyrosjen e ADN-së dyvargore në xhel agaroze me blu metileni, receta standarde e shpejtë është 0.02 për qind w/v (200 mikrogramë për mL) në ujë, me rreth 15 minuta ngjyrosje dhe rreth 15 minuta çngjyrosje me ujë, duke e parë mbi një kuti ndriçimi me dritë të bardhë. Për membranat, receta klasike e Northern blot është 0.02 deri në 0.04 për qind ngjyrues në acetat natriumi afër pH 5.2, disa minuta ngjyrosje pas transferimit dhe imobilizimit, pastaj shpëlarje me ujë dhe çngjyrosje e plotë para hibridizimit. Ndjeshmëria është modeste: dhjetëra deri në qindra nanogramë për brez xheli në kushte të mira, ndërsa udhëzuesit konservatorë japin 0.5 deri në 1 mikrogram. Kjo është disa rende madhësie mbi kufijtë e bromurit të etidiumit dhe ngjyruesve SYBR. Në membrana nuk ka një kufi të vetëm të dobishëm zbulimi për një transkript individual, sepse ngjyruesi tregon kryesisht ARN-në ribozomale të bollshme dhe materialin total të ngarkuar. Mos përdorni në vend të reagentit një tretësirë suplementi të shitjes me pakicë në asnjërën recetë. Metodat e validuara supozojnë përdorimin e ngjyruesit me pastërti analitike, tamponëve të përcaktuar dhe punës pa RNaza kur përfshihet ARN-ja.

Si funksionon lidhja dhe ku mund të mashtrojë

Modeli i dobishëm ka tre pjesë. Së pari, sistemi unazor me ngarkesë pozitive tërhiqet nga skeleti fosfat me ngarkesë negative. Studimet spektroskopike e gjejnë këtë kontribut elektrostatik mbizotërues në përqendrime të ulëta kripe, ndërsa modelimi dhe dinamika molekulare e mbështesin interkalimin dhe lidhjen në brazdën e vogël si mënyra të qëndrueshme për ADN-në dyvargore, siç përmblidhet në një studim spektroskopik të lidhjes së blusë së metilenit me ADN-në. Së dyti, ekziston njëfarë preference për GC, ku modelimi favorizon hapat CpG dhe GpC, ndërsa eksperimentet raportojnë lidhje preferenciale me duplekse të pasura me GC në punimet për preferencat e interkalimit të blusë së metilenit, por edhe duplekset AT e lidhin ngjyruesin. Ngjyrosja rutinë nuk është specifike për sekuencën. Së treti, ADN-ja njëvargore dhe ARN-ja lidhen kryesisht përmes ndërveprimeve elektrostatike dhe stivimit me bazat e arritshme dhe rajonet duplekse, prandaj intensiteti i ngjyrosjes ndryshon sipas gjatësisë, sekuencës dhe strukturës dytësore.

Nga kjo rrjedhin dy pasoja. Meqë lidhja është jokovalente, ngjyruesi largohet me larje. Brezat në poliakrilamid zbehen shpejt nëse nuk fiksohen qëllimisht, dhe një variant i posaçëm me fiksim të përhershëm ekziston pikërisht sepse ngjyrosja normale është e përkohshme, siç përshkruhet nga Soto dhe Draper për xhelet PAGE. Meqë ngjyruesi është fotosensibilizues, ndriçimi i fortë dhe i zgjatur i ADN-së së ngjyrosur në prani të oksigjenit mund të oksidojë guaninën dhe, me kalimin e kohës, të shkaktojë prerje në vargje, një mekanizëm i shtjelluar në punimet për oksidimin e guaninës të fotosensibilizuar nga bluja e metilenit. Vëzhgimi i shkurtër me dritë të bardhë shmang dëmtimin e njohur nga UV-ja në procedurat klasike me bromur etidiumi, dhe ky avantazh është real për rikuperimin preparativ. Drita e dukshme është më e butë, jo e padëmshme. Mbajeni ndriçimin të shkurtër kur ADN-ja do të klonohet. Për fotokiminë më të gjerë që qëndron pas këtij kujdesi, shihni dy rrugët në fotokiminë e blusë së metilenit. Për çiftin redoks dhe gjendjet e ngarkesës që shpjegojnë pse forma e oksiduar lidhet dhe forma e reduktuar jo, shihni kiminë e strukturës dhe vetive të blusë së metilenit.

Detyra e parë: ngjyrosja brenda xheleve

Ngjyrosja e xhelit i përgjigjet një pyetjeje: a ka mjaftueshëm acid nukleik në këtë brez që të shihet me sy? ADN-ja dyvargore në agarozë është rasti më i karakterizuar. Metoda origjinale e ngjyrosjes së xhelit me blu metileni nga Flores dhe kolegët validoi protokollin e shpejtë me 0.02 për qind në agarozë 1 për qind dhe tregoi rikuperim dhe klonim të suksesshëm më pas. I njëjti protokoll i furnizuesit shfaqet në faqen e produktit blu metileni të IBI Scientific, ku receta me 0.04 për qind për membrana dhe varianti i shpejtë për xhele paraqiten krah për krah.

Procedura praktike:

1. Kryeni elektroforezën në xhel si zakonisht. Ngjyroseni pas elektroforezës, jo gjatë saj, përveçse kur transferimi ose rezolucioni është validuar për një metodë të modifikuar.
2. Zhyteni në blu metileni 0.02 për qind w/v në ujë të distiluar, me tundje të lehtë, për rreth 15 minuta.
3. Çngjyroseni duke e ndërruar ujin disa herë, për rreth 15 minuta gjithsej, derisa ngjyrosja e sfondit të matricës të ulet dhe brezat të dallohen.
4. Fotografojeni menjëherë mbi një ndriçues me dritë të bardhë.

Agaroza dhe poliakrilamidi sillen ndryshe. Agaroza e mban ngjyruesin në matricë, prandaj çngjyrosja është hapi i ngadalshëm. Xhelet e holla të poliakrilamidit ngjyrosen shpejt, por edhe e humbasin ngjyruesin shpejt, gjë që ndihmon prerjen preparative të brezave dhe vështirëson dokumentimin arkivor. Oligonukleotidet sintetike në poliakrilamid mund të lokalizohen me të njëjtën recetë 0.02 për qind brenda 20 deri në 30 minutash, me larje të përsëritura me ujë, duke ndjekur metodat e vendosura PAGE të tipit Current Protocols. Janë raportuar variante shumë të holluara, afër 0.0002 për qind në TBE të holluar, për oligonukleotide preparative gjatë disa orëve, por baza e provave është më e dobët.

Dallimi mes ADN-së dhe ARN-së ka rëndësi. ADN-ja dyvargore jep lidhjen e strukturuar më të fortë. ARN-ja dhe ADN-ja njëvargore ngjyrosen, por më dobët dhe në mënyrë më pak të parashikueshme. Për xhelet e ARN-së me agarozë dhe formaldehid, shumica e laboratorëve e anashkalojnë ngjyrosjen me blu brenda xhelit dhe e transferojnë fillimisht ARN-në në membranë, pastaj e ngjyrosin atje. Kjo e zëvendëson sinjalin e dobët në xhel me një sinjal më të qartë në membranë, si dhe me një regjistrim të ngarkimit.

Detyra e dytë: ngjyrosja në membrana

Ngjyrosja e membranës i përgjigjet një pyetjeje tjetër: a funksionoi transferimi dhe a janë korsitë të krahasueshme? Përdorimi klasik është ngjyrosja e kthyeshme e Northern blot sipas Herrin dhe Schmidt, fillimisht me 0.04 për qind ngjyrues në acetat natriumi 50 mM në pH 5.0 për 2 deri në 3 minuta, me shpëlarje me ujë; ngjyruesi mund të hiqet me SDS të holluar në SSPE para hibridizimit.

Varianti modern i përdorur gjerësisht kryhet si më poshtë:

1. Transferoni ARN-në ose ADN-në e denatyruar në najlon ose nitrocelulozë, pastaj imobilizojeni me ndërlidhje me UV ose ngrohje, që mostra të mos humbasë gjatë ngjyrosjes.
2. Opsionale, por e zakonshme: njomeni membranën në acid acetik 5 për qind për rreth 15 minuta.
3. Ngjyroseni për 5 deri në 10 minuta në blu metileni 0.02 deri në 0.04 për qind në acetat natriumi 0.3 deri në 0.5 M afër pH 5.2.
4. Shpëlajeni dhe çngjyroseni në ujë për 5 deri në 15 minuta, dokumentojeni, pastaj hiqni ngjyruesin e mbetur para hibridizimit.

Najloni me ngarkesë pozitive mbizotëron në punën me Northern. Nitroceluloza gjithashtu funksionon me të njëjtën procedurë me acid acetik dhe acetat. Imazhi përdoret për të konfirmuar transferimin, për të krahasuar brezat 28S dhe 18S (ose 23S dhe 16S për ARN-në bakteriale), për të shënuar shkallët molekulare dhe standardet, si dhe për të mbajtur një regjistrim të përafërt për normalizimin ndaj ARN-së totale. Metodat e publikuara Northern matin brezat ribozomalë të ngjyrosur për të kontrolluar ngarkimin, përfshirë punime në shkencën e qumështit që përdorën brezat ribozomalë të ngjyrosur me blu metileni për normalizim. Membranat Southern mund të vizualizohen në të njëjtën mënyrë, por ngjyruesi është shumë më i konsoliduar si kontroll i ngarkimit dhe transferimit në Northern, ndërsa ADN-ja në Southern denatyrohet para transferimit, ndaj shifrat e ndjeshmërisë së xhelit nuk zbatohen drejtpërdrejt.

Kufijtë e zbulimit dhe sfondi: ku bluja mbetet pas

Krahasimi më poshtë është qëllimisht i përafërt. Performanca e ngjyruesit varet nga përqindja e xhelit, gjerësia e brezit, sistemi optik dhe rigoroziteti i çngjyrosjes. Trajtojeni çdo numër si një rend madhësie, jo si një specifikim.

Kontrolli i sfondit përcakton nëse sinjali modest është i përdorshëm. Ngjyruesi i lirë ka ngjyrë intensive, prandaj kontrasti arrihet duke hequr ngjyruesin e palidhur pa larguar atë të lidhur. Ngjyruesi më i përqendruar rrallë shton ndjeshmërinë. Kryesisht shton kohën e çngjyrosjes. Kryeni një seri hollimesh me xhelin, membranën dhe kamerën konkrete dhe përdorni vetëm intervalin ku dendësia e integruar mbetet në përpjesëtim me sasinë e futur. Bluja e metilenit mundëson normalizimin gjysmësasior të ngarkimit. Ajo nuk është një analizë sasiore me interval të lartë dinamik, sepse kapaciteti i membranës, efikasiteti i transferimit, ngopja dhe çngjyrosja ndryshojnë nga një korsi në tjetrën.

Kufijtë e përputhshmërisë: çfarë ruhet pas ngjyrosjes

Klonimi pas ngjyrosjes me blu është demonstruar. Flores dhe kolegët prenë brezat e ngjyrosur të agarozës, rikuperuan ADN-në dhe e përdorën për ligim dhe transformim, duke raportuar klonim më të mirë sesa pas bromurit të etidiumit me UV. Arsyeja e mundshme është dëmtimi më i vogël nga drita, jo ndonjë përfitim nga vetë ngjyruesi. Mbajeni të shkurtër ekspozimin ndaj dritës së bardhë dhe pastrojeni ADN-në e rikuperuar me një procedurë të zakonshme ekstraktimi nga xheli.

Provat për PCR-në dhe sekuencimin janë më të kufizuara. Ngjyruesi i mbetur lidhet me acidet nukleike, prandaj çngjyrosni dhe pastroni para hapave enzimatikë. ADN-ja e pastruar siç duhet nga një xhel i ngjyrosur me blu pritet të funksionojë, por toleranca ndaj ngjyruesit të bartur drejtpërdrejt nuk është matur mirë për polimeraza dhe kimi të ndryshme sekuencimi. Mos e merrni si të mirëqenë.

Hibridizimi në blot është i përputhshëm kur rendi respektohet rreptësisht: transferim, imobilizim, ngjyrosje, dokumentim, çngjyrosje, hibridizim. Kjo sekuencë është modeli i Herrin dhe Schmidt. Ngjyrosja para transferimit ose anashkalimi i çngjyrosjes përbën një metodë tjetër dhe kërkon validim më vete. Pas heqjes së ngjyruesit, heqja standarde e sondës dhe risondimi vazhdojnë normalisht. Për ngjyrosjen në nivel qelizor me të njëjtën familje ngjyruesish dhe arsyen pse parimet e preparateve të fiksuara nuk zbatohen në metodat për qeliza të gjalla, shihni atlasin e ngjyrosjes në mikroskopi.

Prerja e brezave funksionon për agarozën preparative dhe për oligonukleotidet në PAGE të lokalizuara me blu, me kusht që të shmanget varianti me fiksim të përhershëm. Elektroeluimi pas çngjyrosjes është kimikisht i besueshëm për një ngjyrues që lidhet në mënyrë të kthyeshme, por të dhënat e kontrolluara të rendimentit specifike për blunë e metilenit janë të pakta. Hiqni kripërat ose kryeni precipitimin pas eluimit.

Probleme që përsëriten

Brezat e zbehtë në xhel zakonisht nënkuptojnë masë tepër të vogël për një ngjyrosje kolorimetrike, sidomos për objektiva të shkurtra njëvargore ose ARN. Ngarkoni më shumë, përdorni ngjyrues të freskët, zgjatni ngjyrosjen para se të rritni përqendrimin dhe ndalojeni çngjyrosjen më herët. Një xhel krejt blu pa kontrast zakonisht tregon ngjyrosje të tepërt ose ndërrime të pamjaftueshme të ujit. Zbehja e brezave PAGE është pasojë e pritshme e kimisë, jo dështim i ngjyrosjes. Fotografojeni shpejt. Sfondi i pabarabartë në membranë tregon palosje, flluska, gjurmë gishtash, tundje të pabarabartë ose transferim jo të njëtrajtshëm. Mos e interpretoni si ngarkim të pabarabartë pa një kontroll hibridizimi. Një model ribozomal i dobët dhe i shpërndarë mund të nënkuptojë degradim, por edhe transferim jo të plotë, shumë pak ARN totale (korsitë tipike mbajnë nga disa deri në dhjetëra mikrogramë) ose çngjyrosje të tepërt. Ngjyruesi tregon ARN-në ribozomale të bollshme. Ai nuk tregon një transkript specifik. Kjo detyrë i takon sondës.

Siguria dhe trajtimi pa pretendime të tepruara

Bluja e metilenit është më e thjeshtë për t’u trajtuar sesa bromuri i etidiumit, por nuk është e padëmshme. Një fletë aktuale e të dhënave të sigurisë nga MilliporeSigma e klasifikon ngjyruesin në Kategorinë 4 të toksicitetit akut oral, të dëmshëm nëse gëlltitet, me asgjësim përmes një rruge të miratuar për mbetjet, sipas SDS-së së Sigma-Aldrich për blunë e metilenit. Bromuri i etidiumit ka paralajmërime më të forta për gjenotoksicitetin, përfshirë efekte të dyshuara mbi qelizat germinale në SDS-në e Sigma-Aldrich për bromurin e etidiumit, dhe xhelet e tretësirat e tij zakonisht ndahen si mbetje kimike të rrezikshme, siç vërehet në udhëzuesin e Thermo Fisher për ngjyruesit e acideve nukleike. Ndiqni SDS-në dhe rregullat institucionale për të dy. Mbajeni ngjyruesin e thatë të mbyllur hermetikisht dhe në kushte të thata, ripërdoreni tretësirën e punës vetëm siç lejon protokolli, ruajini membranat e ngjyrosura të thata midis fletëve të letrës filtruese dhe fotografojini xhelet para se brezat të shpërndahen nga difuzioni.

Mbajeni mend përmbledhjen për tavolinën e laboratorit. Xhelet testojnë dukshmërinë në ngarkesa të larta nën dritë të bardhë. Membranat testojnë transferimin dhe ngarkimin para se sonda të kryejë punën e ndjeshme. Një ngjyrues u shërben të dyjave, me ndjeshmëri modeste, lidhje të kthyeshme dhe rend të rreptë veprimesh.