Paul Ehrlich in metilensko modrilo: kako je barvilo pomagalo oblikovati odkrivanje zdravil

Prispevek Paula Ehrlicha k medicini ni bilo zdravilo. Bil je razmislek o tem, kako zdravilo preučevati.

Leta 1878 je predložil doktorsko disertacijo, katere uvodni del je nosil naslov »Kemijsko pojmovanje barvanja«. V njej je zagovarjal stališče, da barvanje tkivnega reza in barvanje kosa blaga sledita isti logiki. V obeh primerih se barvilo veže zaradi kemijske afinitete med barvilom in materialom, ne zato, ker tkivo vpija, je mastno ali ima obliko, ki ujame pigment. Ehrlich je odraščal ob opazovanju svojega bratranca, patologa Karla Weigerta, pri pripravi obarvanih rezov. Njegove pozornosti niso pritegnile podobe, temveč dejstvo, da je barvilo izbiralo, kam se bo vezalo.

Trditev zveni skromno. Pa ni. Če se barvilo veže na tkivo iz kemijskih razlogov, potem vzorec obarvanja poroča o kemiji tega tkiva. Obarvan preparat tako ni več ilustracija, temveč meritev.

Na tej podlagi je takoj gradil naprej. Leta 1880 je združil metilensko modrilo s kislim fuksinom in mešanico poimenoval nevtralno barvilo, neutralen Farbkörper. Z njo je razlikoval med vrstami belih krvničk, česar posamezna barvila, ki so jih takrat uporabljali, niso omogočala. Dve leti pozneje je predstavil metodo barvanja bacilov tuberkuloze z metilvijoličnim barvilom, Koch pa je postopek prevzel pri svojem delu.

Teorija, ki je pozneje tem postopkom dala skupno podlago, je ločena zgodba, njen časovni okvir pa se pogosto poenostavlja. Ehrlichova teorija stranskih verig, zamisel, da snov deluje na celico, ker sta kemijsko združljivi, sodi v 1890. leta, ne v obdobje njegovih zgodnjih raziskav barvil. Zgodnejše delo je prispevalo predhodno prepričanje: selektivnost je kemijska, zato jo je mogoče načrtno iskati, ne le naključno odkriti.

Poskus, ki je barvilo spremenil v zemljevid

Leta 1885 je Ehrlich objavil monografijo o potrebah organizma po kisiku s podnaslovom študija z barvno analizo. Njegova metoda je bila vbrizgavanje barvil, katerih barva je odvisna od oksidacijskega stanja, in nato primerjava, kako jih različni organi reducirajo ali ohranjajo. Barvilo je uporabljal kot instrument, podobno kot uporabljamo termometer: poročalo je o razmerah v tkivu, ki jih ni bilo mogoče neposredno preučiti. Ehrlich je cilj sam opredelil kot določanje redukcijske sposobnosti živih organov s pomočjo določenih barvil.

Rezultat z metilenskim modrilom je sledil leta 1886 v članku o reakciji barvila z živo živčno snovjo, ki ga je pred zdravniškim društvom predstavil decembra prejšnjega leta. Metilensko modrilo so vnesli v krvni obtok žive živali, nato odstranili tanke rezine tkiva in jih izpostavili zraku, da je nakopičeno brezbarvno barvilo oksidiralo nazaj v modro obliko ter pokazalo, kje se je nabralo. Živčne celice in živčna vlakna so se obarvala dovolj selektivno, da je tehnika postala standardna metoda za prikaz živčnega tkiva. Spojina ni bila več zgolj barvilo, naneseno na odmrl tkivni rez na laboratorijski mizi. Postala je označevalec, ki se je porazdelil po živem telesu, to porazdelitev pa je bilo mogoče razbrati.

Lastnost, na kateri sta temeljila oba poskusa, je treba jasno opisati, saj je od nje odvisno vse drugo v tej zgodbi. Pretvorba metilenskega modrila je reverzibilna. Njegova reducirana oblika, levkometilensko modrilo, je brezbarvna, ob stiku s kisikom pa se znova spremeni v modri kation. Raztopina barvila z glukozo v zaprti posodi je brezbarvna; ko posodo odpremo, postane modra. Ehrlich naj bi to neposredno pokazal, ko je obarvane reze obdelal z železovim kloridom in jih izpostavil zraku ter opazoval vrnitev barve. Barvilo, ki spreminja barvo glede na redoks stanje svoje okolice, je sonda za preučevanje te okolice.

Tako sta se druga ob drugi znašli dve lastnosti. Barvilo je lahko razlikovalo med tkivi. Sprememba oksidacijskega stanja pa je lahko njegovo obarvanost vklopila ali izklopila.

Če pogledamo za nazaj, je druga lastnost začetek kemoterapije. Če se spojina veže na eno vrsto tkiva in ne na drugo, bi lahko ista spojina dosegla eno vrsto organizma in ne druge. Ehrlich je sklep izrazil neposredno: če je mogoče povzročitelja bolezni selektivno obarvati, bi obarvanje lahko nakazovalo specifično škodljivo delovanje na tega povzročitelja. Barvilo bi torej lahko uporabljali kot zdravilo, usmerjeno proti vsiljivcu, ne proti bolniku.

Prvi preizkus pri bolniku ni bil povezan z malarijo. Leta 1890 je Ehrlich skupaj s psihiatrom Arthurjem Leppmannom poročal, da metilensko modrilo lajša bolečine pri nevralgičnih in revmatičnih stanjih mišic, sklepov in kit. Razpravljala sta o tem, ali bi zdravilo lahko delovalo pri duševnih boleznih, in se odločila, da tega ne bosta preizkusila. Italijanski zdravnik Pietro Bodoni iz Genove je kljub temu nadaljeval. Naslov njegovega članka iz leta 1899 se nanaša na pomirjevalno delovanje pri različnih oblikah psihoze: opisal je umiritev pri štirinajstih vznemirjenih bolnikih in navedel, da so tudi drugi genovski zdravniki barvilo že uporabljali v isti namen. Sedacija ni učinek na samo bolezen in ta razlika se v tej zgodovini vedno znova pojavlja.

Raziskave malarije so sledile leta 1891, skupaj s patologom Paulom Guttmannom, v berlinski bolnišnici Moabit. Metilensko modrilo sta prejela dva bolnika, poročilo pa je izšlo v reviji Berliner klinische Wochenschrift 28. septembra 1891. V prvem primeru je bolnik zvečer 29. junija naenkrat zaužil 0.5 g barvila; pričakovani napad se ni v celoti razvil, edina pozneje zabeležena težava pa je bila blaga strangurija z modrim urinom. Napadi vročine so v prvih dneh izginili, parazitov pa najpozneje osmi dan ni bilo več v krvi. Avtorja sta v svojem povzetku zapisala, da so se njuna pričakovanja v celoti izpolnila. Dva primera brez kontrolne skupine nista dokaz. Podrobnejši opis metilenskega modrila in malarije, vključno s sodobnimi preskušanji, sodi na svojo stran. Tukaj je zanimivo ožje vprašanje: koliko Ehrlichovega sklepanja je prestalo soočenje s parazitom.

Kje je sklepanje vzdržalo in kje je odpovedalo

Od predlaganega mehanizma ni ostalo veliko, vsaj ne v obliki, ki jo je predlagal Ehrlich. Urejena razlaga, po kateri ploščat triciklični kation zdrsne med bazne pare parazitove DNA, pri rodu Plasmodium ne vzdrži. Okužena rdeča krvnička metilensko modrilo tako zlahka reducira, da do parazita sploh ne pride kot planaren kation. Razlaga z interkalacijo, ki ustreza akridinskim barvilom, temu barvilu ne ustreza.

Razlaga, ki jo dokazi podpirajo, je manj urejena. Metilensko modrilo zavira parazitovo glutation-reduktazo pri koncentracijah, ki jih je mogoče doseči pri bolniku. Zavira pretvorbo hema v hemozoin, inertni pigment, ki ga parazit tvori, da se izogne zastrupitvi zaradi lastne razgradnje hemoglobina, približno enako učinkovito kot klorokin in precej učinkoviteje kot kinin. Njegovo redoks kroženje ustvarja tudi reaktivne kisikove zvrsti v celici, ki jih že sicer proizvaja. Kateri od teh mehanizmov je dejanski oziroma ali prispevajo vsi, še ni razjasnjeno.

Obstaja še dodaten zaplet, ki bi moral usmerjati branje vsake zgodovinske trditve o tej spojini. Komercialno metilensko modrilo tistega časa ni bilo ena sama snov. Vzorci so vsebovali Azure B, monodemetilirani sorodni derivat, v starejših raztopinah pa se ga je nabralo še več. Azure B je metakromatsko barvilo z drugačnimi tarčami: dvoverižno DNA obarva temno modro, RNA pa zeleno. Mešanica dveh barvil, ki se porazdelita na različna mesta, v razmerjih, ki jih nihče ni zabeležil, ne omogoča jasne trditve o tem, kaj je v njej naredilo metilensko modrilo.

Samo barvilo ni nikoli izpodrinilo kinina. Metoda je bila uspešnejša. Ehrlichov učenec Wilhelm Roehl, ki je delal za koncern barvil in zdravil IG Farben, je še naprej razvijal derivate barvil kot zdravila za tropske bolezni in prispeval manjkajoče orodje: kanarčka, okuženega s ptičjo malarijo, kot rutinski model za presejanje kandidatnih spojin. Werner Schulemann je nato spremenil stransko verigo in nastala fenotiazinijeva sol je pozdravila poskusno okužbo. Bolnike je še vedno obarvala modro.

Trajni rezultat ni bilo ne barvilo ne obročni sistem, temveč stranska veriga. Dodatek dialkilaminoalkilamino skupine je spremenil obnašanje molekule, ta del strukture pa se je ohranil pri vseh poznejših preoblikovanjih. Če to skupino ohranimo in fenotiazinijev obroč zamenjamo z akridinskim, dobimo kinakrin. Če ga zamenjamo s kinolinskim, dobimo klorokin. Pamakin, primakin in amodiakin, ki so še vedno v naboru antimalarikov, vsebujejo isto skupino. Spojina, ki se kot zdravilo ni uveljavila, je prispevala del, ki je uspel.

Povezava z antipsihotiki poteka prek obroča, ne prek zdravila. Razjasnitev strukture metilenskega modrila je Heinricha Augusta Bernthsena leta 1883 pripeljala do osnovnega fenotiazinskega jedra. Prav to ogrodje z različnimi substituenti so kemiki pri Rhône-Poulenc preučevali v 1940. letih med iskanjem antihistaminikov. Eno od teh spojin so sintetizirali proti koncu leta 1950, preizkusil pa jo je kirurg Henri Laborit, ki je opazil, da so bili bolniki po njej mirni in ravnodušni. Prva objavljena psihiatrična uporaba pri bolniku z manijo je sledila januarja 1952. Prvi antipsihotik ni toliko potomec Ehrlichovega antimalarika kot daljni sorodnik barvila, s katerim je začel.

Tri navade, ki jih je vredno ohraniti iz te zgodbe

1. »Prvo sintetično zdravilo, uporabljeno v medicini« opisuje kategorijo, omejitve pa so večje, kot nakazuje izraz. Izraz se je ustalil; pogosto citiran pregled Schirmerja in sodelavcev v reviji Neurobiology of Aging metilensko modrilo označuje za čisto prvo povsem sintetično zdravilo, uporabljeno v medicini. Kloral hidrat so kot sintetično pomirjevalo uvedli leta 1869, več kot dvajset let prej. Del odgovora ponuja že članek iz leta 1891, saj avtorja naštevata sintetične antipiretike, ki so se že izkazali za neuspešne proti malariji, med njimi kinolin, antipirin in antifebrin. Ehrlichova lastna arzenova spojina za sifilis je prišla še pozneje. Utemeljiva različica trditve se nanaša na metodo, ne na prvenstvo: metilensko modrilo sodi med najzgodnejše sintetične spojine, izbrane za delovanje proti določenemu organizmu na podlagi kemijske teorije selektivnosti.
2. Selektivna porazdelitev ni isto kot selektivna korist. Ehrlichov rezultat iz leta 1886 je pokazal, da barvilo prehaja v živčno tkivo. Kam spojina pride in kaj naredi, ko prispe, sta dve različni meritvi, prvo pa je veliko lažje opraviti. Prav v tej vrzeli se od takrat nahaja večina trditev o metilenskem modrilu in možganih.
3. Čistost sodi med dokaze, ne v trženje. Zgodovinski zapisi so dvoumni prav zaradi tega. Majhne strukturne razlike spremenijo, kam ta spojina prehaja, zato mora biti certifikat analize vezan na določeno serijo, ne pa ponujen kot splošna izjava, da je izdelek testiran. Prodajalec, ki trdi, da izdelek ustreza farmakopejski monografiji, obenem pa preverja le težke kovine, trdi več, kot podpira poročilo. Blupreme metilensko modrilo pridobiva od farmacevtskega proizvajalca in preverja celotno specifikacijo, določeno v monografiji: identiteto, čistost, organske nečistote, ostanke topil, elementarne nečistote, ostanek po žarenju, mikrobiološke mejne vrednosti in bakterijske endotoksine. Poročilo je objavljeno ob izdelku, stran o metilenskem modrilu kakovosti USP pa pojasnjuje te mejne vrednosti in zakaj je treba najprej preveriti rezultat za Azure B.

Kronološki pregled virov

Kronološko zaporedje mejnikov, vključno s kemijo barvil pred Ehrlichom ter kakovostnimi razredi in specifikacijami po njem, je ločeno predstavljeno v zgodovini metilenskega modrila, sama identiteta spojine pa je obravnavana v članku kaj je metilensko modrilo.

Slikovno gradivo, na katerem temelji ta prikaz in ki je reproducirano v pregledu Krafts, Hempelmann in Skórska-Stania iz leta 2012, ni enakovredno, kar pokaže en primer. Slikovni prikaz iz leta 1891 je primarni zapis preskušanja; portret iz leta 1910 ob njem časovno umešča sloves in nič drugega. Strani iz Andersagovega zvezka iz leta 1934 so neposredna sled zamenjave s kinolinskim obročem, zapisana z roko samega kemika.

Pošten povzetek Ehrlichovih poskusov z barvili je, da je pravilno prepoznal selektivnost in tarčo, zgrešil pa mehanizem. Metilensko modrilo se res kopiči v živčnem tkivu in res škoduje parazitu malarije. Drugega ne počne zaradi prvega, kemijska razlaga, ki jo je ponudil za oboje, pa je bila napačna. Kar je nedvomno pokazal, je bilo trajnejše od pravilnega mehanizma: spojino je mogoče izbrati, ne le najti, in jo izbrati na podlagi dokazov, zbranih, še preden jo kdo da bolniku.