Kako metilensko modrilo vstopa v celice: redukcija, reoksidacija, privzem

Če opazujete, kako endotelijske celice v posodi privzemajo metilensko modrilo, je najočitnejša razlaga hkrati tudi napačna. Medij izgubi modro barvo, v celicah se pojavijo modra zrnca, zato naj bi barvilo prešlo skozi membrano v obliki modre molekule. Poskusi kažejo drugače. Modra oblika komaj prehaja skozi membrano. Prehaja brezbarvna oblika, modrina, ki jo vidite v notranjosti, pa nastane tam, šele po vstopu.

Ta obrat je pomemben, ker določa, kaj lahko razberemo iz obarvanja in česa ne. Modra zrnca kažejo oksidirano barvilo, ki se je ponovno oksidiralo in ostalo ujeto v organelih. Ne kažejo celotne količine barvila v celici, ne kažejo reducirane zaloge in ne merijo biološkega učinka. Da bi razumeli, zakaj, sledite trem korakom: redukciji na površini, difuziji reducirane oblike ter reoksidaciji in zadrževanju v notranjosti.

Obliki se vedeta kot različni molekuli

Oksidirano metilensko modrilo je ploščat, pozitivno nabit obročni sistem. Topi se v vodi, močno absorbira svetlobo pri približno 600 do 700 nanometrih in je videti modro. Ključen je naboj. Nabita, hidrofilna molekula ne prehaja zlahka skozi lipidno membrano, zato je previdna formulacija v literaturi, da membrano prehaja razmeroma slabo, ne pa, da je sploh ne prehaja.

Reducirano metilensko modrilo, imenovano levkometilensko modrilo, je brezbarvno, nenabito in topno v maščobah. Ko odstranimo naboj, membrana ni več ovira. Reducirana molekula zlahka difundira skoznjo, ko pa pride v bolj oksidativen predel, lahko znova odda elektrone in se vrne v modro, nabito obliko, ki ostane ujeta. Redoks kemija barvila je zato tudi njegov transportni mehanizem. Če spremenite število elektronov, spremenite prehajanje skozi membrano.

Elektrone za prvi korak zagotavlja celica sama. Celice sesalcev prenašajo elektrone prek plazemske membrane, pri čemer premikajo redukcijske ekvivalente iz znotrajceličnih donorjev navzven do akceptorjev na površini. Ta aktivnost prenosa prek plazemske membrane je običajna celična funkcija, prisotna pri večini vrst celic. Endotelijska površinska reduktaza, ki deluje na tiazinska barvila, pa se v enem povednem pogledu vede podobno kot druge: deluje tudi v prisotnosti cianida in azida pri odmerkih, ki ustavijo poznejše korake. Prav ta ločitev je osrednja točka celotne zgodbe.

Najprej je bilo porazdeljevanje, ki je skoraj pojasnilo privzem

Leta 1929 si je Marian Irwin na Rockefellerjevem inštitutu zastavila preprostejše vprašanje. Morda je vstop barvila le porazdeljevanje med vodo in maščobnimi plastmi celice, plast kloroforma pa bi lahko v laboratoriju nadomestila te maščobne plasti. V svojih spektrofotometričnih raziskavah prodiranja je vodne raztopine barvila stresala s kloroformom in primerjala prehod v organsko fazo z vstopom v žive celice alg.

Dve ugotovitvi iz tega dela sta še vedno vredni pozornosti. Prvič, komercialne raztopine metilenskega modrila so vsebovale trimetiltionin, danes imenovan Azure B, ta nečistoča pa je prodirala hitreje kot samo metilensko modrilo, zlasti pri alkalnem pH, pri katerem prevladuje v lipidih topna oblika proste baze. Del navideznega vstopa metilenskega modrila je bil v resnici selektiven vstop Azure B. Drugič, pH je z določanjem ionizacijskega stanja določal izid, poškodovane celice pa so prepuščale veliko več barvila kot nepoškodovane. Porazdelitveni koeficienti in stanje naboja so določali, kaj sta sprejela umetni sistem in živa celica, podobnost med njima pa je podpirala zamisel o nevodnih plasteh na celični meji.

Model je bil daljnoviden glede lipidov in ionizacije, vendar ni mogel razlikovati med barvilom, ki se porazdeljuje v nespremenjeni obliki, in barvilom, ki se na površini kemično pretvori, prečka membrano v drugi obliki in se v notranjosti pretvori nazaj. Za to razlikovanje je bil potreben drugačen poskus, ki je sledil sedemdeset let pozneje na pljučnem endoteliju.

Redukcija zunaj, zadrževanje znotraj

Merker in sodelavci so delali z gojenimi endotelijskimi celicami goveje pljučne arterije in predlagali zaporedje treh korakov: oksidirano barvilo se na celični površini reducira v brezbarvno lipofilno obliko, reducirana oblika difundira v notranjost, znotrajcelična reoksidacija pa obnovi oksidirano obliko, ki ne prehaja skozi membrano in se zato kopiči. V svoji raziskavi endotelijskega privzema tiazinskih barvil so nato preverili to zaporedje tako, da so ga poskušali prekiniti na določenih mestih.

Prvo orodje je bil fericianid, akceptor elektronov, ki ne more vstopiti v celico. Ko površinski encimi zunaj celice reducirajo modro barvilo v brezbarvno obliko, mu lahko fericianid te elektrone znova odvzame in tako obnovi modro barvilo v mediju, še preden to prečka membrano. Dokler je bil fericianid prisoten v presežku (10 mikromolarno barvilo v primerjavi s 50 do 500 mikromolarnim fericianidom), se je privzem barvila skoraj ustavil. Šele ko se je fericianid porabil, se je privzem nadaljeval z običajno hitrostjo. Kinetika je isto pokazala še na drug način. Fericianid je izginjal s približno stalno hitrostjo, kar je skladno s stalnim tokom površinske redukcije, ki napaja mediator z možnostjo ponovnega kroženja, medtem ko je zunajcelično barvilo izginjalo eksponentno, ko se je njegova zaloga izčrpavala. Stalen tok ob hkratnem izčrpavanju zaloge pomeni, da signal fericianida kaže neprekinjeno redukcijo, ne pa molekul barvila, ki zapuščajo raztopino.

Drugo orodje je korak prehajanja povsem odstranilo. Raziskovalna skupina je toluidinsko modrilo O, bližnje sorodno tiazinsko barvilo, vezala na veliko poliakrilamidno verigo, preveliko, da bi lahko vstopila v celico v katerem koli oksidacijskem stanju. Celice so vezano barvilo kljub temu reducirale. Redukcija torej ne zahteva dostopa do notranjosti celice. Mehanizem je izpostavljen na površini ali pa je z njo električno povezan.

Nato je sledila ločitev, po kateri je članek dobil naslov. Cianid in azid pri 2 milimolarni koncentraciji sta močno zavrla kopičenje barvila, pod mikroskopom pa so temno modri in vijolični vključki, ki običajno obdajajo jedro, skoraj izginili. Vendar noben od zaviralcev ni upočasnil zunajcelične redukcije: kroženje fericianida se je nadaljevalo nezmanjšano, polimer, ki ne prehaja skozi membrano, pa se je še vedno reduciral. Blokada je bila v poznejšem koraku. Cianid in azid sta ustavljala znotrajcelično reoksidacijo in zadrževanje, ne pa površinske redukcije. Kontrolni preizkusi viabilnosti so podprli to razlago, saj so celice med temi obdelavami zadržale svoj citosolni označevalni encim laktat dehidrogenazo. Izguba privzema torej ni bila zgolj posledica zastrupitve ali pretrganja membrane.

Eno opozorilo iz članka velja še danes. Modri vključki so bili okoli jedra, ne pa v njem, kar je skladno z oksidacijo znotraj podceličnih organelov, vendar raziskava ni določila, za katere organele gre. Podobne vzorce v drugih vrstah celic so na podlagi šibkih dokazov označevali za lizosomske. Zadrževanje obravnavajte kot potrjeno, natančno mesto pa kot še nedoločeno. Bralci, ki spremljajo, kam elektroni potujejo naprej, lahko nadaljujejo z mitohondrijskim prenosom elektronov in redoks procesi ter širšim pregledom absorpcije in porazdelitve glede na pot vnosa.

Obarvanje ni izpostavljenost

Tretja raziskava pokaže, kaj se zgodi, ko se ta mehanizem privzema poveže z merjenjem biološkega odziva. Scott in sodelavci so ugotovili, da metil beta ciklodekstrin, sladkorna molekula v obliki obročastega torusa, neposredno veže metilensko modrilo, pri čemer je asociacijska konstanta za inkluzijski kompleks približno 310 na molarno enoto, za dimerizacijo barvila pa približno 5846 na molarno enoto. V fibroblastih L929 je ta vezava preprečila tako obarvanje celic kot spodbujanje privzema glukoze: predinkubacija s ciklodekstrinom je preprečila modro obarvanje, njegovo poznejše dodajanje pa je pospešilo razbarvanje. Ko je optični modri signal izginjal iz celic, je tesno vzporedno z njim upadal tudi aktivirani transport glukoze.

Avtorji so to korelacijo razumeli kot podporo neposredni interakciji med barvilom in beljakovino v poti aktivacije prenašalca glukoze, ne pa mehanizmu dolgotrajnega oksidativnega stresa. Tak sklep je razumen, vendar omejen. Poskus ne določi beljakovine, ne pokaže vezave na sam prenašalec, korelacija med razbarvanjem in izgubo učinka pa ne more izključiti vseh poti, posredovanih z redoks procesi.

Trajni nauk se nanaša na merjenje. Optično obarvanje kaže vidno, oksidirano barvilo, povezano s celico. Brezbarvno reducirano zalogo povsem spregleda, zato lahko bleda celica še vedno vsebuje ekvivalente barvila, intenzivno obarvana celica pa kaže ujeto oksidirano barvilo, ne celotne izpostavljenosti tkiva ali velikosti učinka. Isto opozorilo velja tudi v širšem merilu: primerjanje obarvanja med vrstami celic ali obravnavanje temnega tkivnega reza kot dokaza večje izpostavljenosti ponavlja prvotno napako pri opazovanju celic v posodi. Privzem je cikel redukcije, difuzije in reoksidacije, vsak posamezen posnetek modre oblike pa pokaže le en njegov del. Iz tega neposredno izhajajo praktične posledice za laboratorijsko barvanje in ravnanje ter za razlago trditev o odmerku in izpostavljenosti.