Metilensko modrilo in levkometilensko modrilo: en redoks par, dve barvi

Študentka v bučko doda nekaj kapljic modrega barvila, jo zavrti in opazuje, kako barva izgine. Bučko pretrese in modra barva se vrne. Med obema stanjema ni bilo nič dodano ali odstranjeno, razen elektronov in stika z zrakom. V tej bučki je zajeta celotna tema tega članka: metilensko modrilo in njegov reducirani partner, levkometilensko modrilo, ki se medsebojno pretvarjata v reverzibilnem redoks paru, pri katerem barva pokaže stanje.

Najprej praktično bistvo. Sprememba barve tu ni stranski učinek. Je analitski signal. Kdor z metilenskim modrilom pripravlja formulacije, titrira ali poučuje, bi moral znati polreakcijo zapisati na pamet, navesti pogoje, ki jo usmerjajo v levo ali desno, in poimenovati nečistoče, ki zameglijo rezultat.

Par v eni enačbi

Oksidirano metilensko modrilo je metiltioninijev kation: planaren fenotiazinijev sistem z žveplom in dušikom v osrednjem obroču ter dimetilamino skupino na vsakem koncu, dobavljen kot kloridna sol. PubChem ga navaja kot metiltioninijev klorid, C.I. Basic Blue 9. V vodi monomer absorbira pri približno 664 nm, kar ustreza modri barvi, ki jo zazna oko.

Reducirano levkometilensko modrilo (LMB) ima enako ogrodje, vendar je dušik v osrednjem obroču protoniran, kromofor pa prekinjen. Pri skoraj nevtralnem pH je brez naboja in skoraj brezbarvno, z zanemarljivo absorbanco v vidnem delu spektra in močnim ultravijoličnim pasom pri približno 258 nm (vnos v PubChem za levkometilensko modrilo, CAS 613-11-6). Število protonov v polreakciji je odvisno od pH, ker se reducirana oblika v kislem okolju protonira (približni vrednosti pKa sta 4.5 in 5.8). Praktično območje zajemajo trije režimi:

MB(+) + 2 e(-) + H(+) <=> LMB, modro <=> brezbarvno (skoraj nevtralen pH, 1 proton)

MB(+) + 2 e(-) + 2 H(+) <=> LMBH(+), modro <=> brezbarvno (zmerno kislo, 2 protona)

MB(+) + 2 e(-) + 3 H(+) <=> dvojno protonirana levko zvrst (močno kislo, 3 protoni)

Vsi trije zapisi opisujejo isti par pri različnih protonacijskih stanjih, kar literatura o redoks obnašanju tiazinskih barvil sistematično obravnava. Odvisnost od pH sledi Nernstovi enačbi za Ox + mH(+) + 2e(-) <=> Red, ki daje naklon približno 29.6, 59.2 ali 88.7 mV na enoto pH za m = 1, 2 ali 3. Izmerjeni nakloni blizu 28, 58 in 87 mV na enoto pH potrjujejo to razvrstitev, zato navedeni potencial brez pripadajočega pH nima pomena.

Kaj enačba pove razvijalcu formulacij

Iz stehiometrije izhajajo tri dejstva. Prvič, dva elektrona na molekulo pomenita, da je metilensko modrilo v svoji skupni reakciji dvoelektronski indikator in mediator, ne enoelektronski prenašalec. Drugič, sodelujejo protoni, zato se formalni potencial spreminja s pH, kot je opisano zgoraj. Tretjič, formalni potencial pri pH 7 je blizu +0.011 V glede na standardno vodikovo elektrodo (približno +0.53 V pri pH 0), kar par uvršča med blage oksidante: dovolj močne, da sprejmejo elektrone od dobrih donorjev, kot sta NAD(P)H ali askorbat, in dovolj šibke, da jih predajo raztopljenemu kisiku ali centrom z železom(III). Prav ta vmesni položaj omogoča, da barvilo kroži med oblikama, namesto da bi obstalo na enem koncu.

Koncentracija prinaša še en zaplet. Nad približno sto mikromolar v vodi, kar je skladno z navedeno disociacijsko konstanto ravnotežja monomer–dimer blizu 170 do 250 uM pri pH 7, se oksidirani kationi zlagajo v dimere in višje agregate s premaknjenim absorpcijskim pasom pri približno 610 do 615 nm. Spekter z navidezno premaknjenim vrhom lahko zato pomeni agregacijo, ne nečistoče. Najprej razredčite, nato presodite.

Pogoji, ki usmerjajo reakcijo v vsako od obeh smeri

Spodnja tabela je priročen laboratorijski pregled. Redukcija potrebuje donor elektronov; ponovna oksidacija potrebuje akceptor elektronov, pri čemer običajno zadostuje zrak.

Vsaka vrstica sledi isti enačbi. Spreminja se le gonilna sila. V tem smislu je par reverzibilen: pot je enaka, le da poteka v nasprotnih smereh pri nasprotnih pogojih.

Razlaga modre steklenice

Mehanizem te demonstracije si zasluži jasno razlago, saj predstavlja ta par v malem. V alkalni raztopini glukoze baza spodbuja enolizacijo glukoze, nastali enediolat pa reducira metilensko modrilo v levkometilensko modrilo, zato vsebina bučke postane brezbarvna. Stresanje raztopi kisik iz plinskega prostora nad raztopino, kisik ponovno oksidira levko obliko in modra barva se vrne. Med mirovanjem se raztopljeni kisik v bližini površinskega reakcijskega območja porabi in glukoza znova prevlada. Cikel se ponavlja, dokler se glukoza ne porabi, vsako stresanje pa je vidna ponazoritev Nernstove enačbe: povečanje aktivnosti oksidanta premakne ravnotežje proti modri obliki.

Radikal na sredini

Skupna reakcija prenese dva elektrona, vendar elementarni koraki prenašajo po enega. Med modrim kationom in brezbarvno levko obliko je semikinonski radikalski intermediat, ki večinoma disproporcionira nazaj v obe obliki para, namesto da bi se kopičil. Njegov enoelektronski potencial blizu minus 0.23 V pri pH 7 je precej nižji od skupnega dvoelektronskega sredinskega potenciala, zato radikal ostaja manj zastopana zvrst v stacionarnem stanju. Pomemben je iz dveh razlogov. Ob osvetlitvi barvilo preide v vzbujena stanja, ki odprejo radikalske reakcijske poti; zato so raztopine metilenskega modrila občutljive na svetlobo in zato fotokemija sodi v vsak protokol preverjanja stabilnosti. Pri visoki koncentraciji pa oksidirana oblika dimerizira, kar spremeni spekter in navidezno kinetiko, ne da bi spremenilo osnovni par. Nobeno od teh dejstev ne izniči reverzibilnosti. Obe pojasnjujeta opažanja, ki so sicer videti kot ireverzibilnost.

Demetilirani sorodniki premaknejo lestvico

Če z obeh dimetilamino skupin odstranimo metilne skupine, se par ohrani, vendar s spremenjenimi lastnostmi. Absorpcijski maksimum se z vsako demetilacijo monotono premika proti modremu delu spektra: metilensko modrilo pri približno 664 nm, Azure B pri približno 654, Azure A pri približno 630, Azure C pri približno 615 in tionin pri približno 600 nm. Azure B, ki mu manjka ena metilna skupina, je najbližji sorodnik: pomemben presnovek metilenskega modrila in dokumentirana nečistoča v surovini metilenskega modrila. Azure A in Azure C nadaljujeta niz z istim redoks aktivnim ogrodjem. Tionin, pri katerem sta obe amino skupini popolnoma demetilirani, je na koncu niza s formalnim potencialom blizu +0.06 V pri pH 7 v primerjavi z metilenskim modrilom pri +0.011 V, zato ga je opazno lažje reducirati. Redoks potenciali v tem nizu so odvisni od medija in elektrode, zato vrednosti primerjajte le pri enakih pogojih. Zato je profiliranje nečistoč redoks vprašanje, ne zgolj kljukica pri preverjanju čistosti. Nekaj odstotkov Azure B pomeni nekaj odstotkov drugačnega redoks para v steklenici, članek Azure B kot nečistoča in presnovek pa dokumentira, kako se ta delež nadzoruje.

Kje se vključi biologija

V rdeči krvnički NADPH reducira metilensko modrilo v levkometilensko modrilo, levko oblika pa preda elektrone železu(III) v hemu in s tem obnovi stanje železa(II) v hemoglobinu. Ta prenos elektronov je kemijska osnova uporabe metilenskega modrila pri pridobljeni methemoglobinemiji. Vse, kar sledi temu prenosu — energijska presnova, mitohondrijski tok elektronov in kakršen koli biološki izid — sodi v temo mitohondrijskega transporta elektronov in je namenoma prepuščeno tistemu članku.

Kupite par, ne le barve

Redoks barvilo je le toliko dobro, kolikor je dobra njegova specifikacija. Visoka čistost je pomembna, ker je metilensko modrilo, ki ne ustreza USP, običajno kakovosti za tekstilno industrijo in vsebuje Azure B, težke kovine ali ostanke topil, ki premikajo redoks odčitke in zameglijo končne točke; noben protokol barvanja teh ne preverja. Večina prodajalcev, ki trdijo, da izpolnjujejo zahteve USP, preveri le težke kovine in razglasi uspeh. Popolna skladnost zajema identiteto, določanje vsebnosti, organske nečistoče, ostanke topil, elementne nečistoče, ostanek po žarjenju, mikrobiološke mejne vrednosti in bakterijske endotoksine, članek kako izbrati metilensko modrilo farmacevtske kakovosti pa pojasnjuje, kako brati to dokumentacijo. Blupreme sodeluje s farmacevtskim proizvajalcem metilenskega modrila, preverja celotno specifikacijo USP in objavlja popoln analizni certifikat (COA). Kadar je barva meritev, je ta dokumentacija del instrumenta.