Barvanje z metilenskim modrilom: mikroskopske metode in atlas resničnih posnetkov

Barvanje z metilenskim modrilom omogoča lažje razlikovanje sicer slabo vidnih celičnih značilnosti pri mikroskopiji v svetlem polju. Učencem lahko pomaga poiskati jedro celice ustne sluznice ali preučiti obris in razporeditev mikroorganizmov. Moder objekt pa je zgolj opažanje. Poimenovanje organizma, njegovo merjenje in presoja, ali nakazuje bolezen, so ločene naloge.

Naslovna slika ponazarja načelo kontrasta. Spodnji atlas vsebuje resnične fotografije neodvisno dokumentiranih vzorcev z izvirnimi podatki o njihovih virih.

Kaj razkrije metilensko modrilo?

Metilensko modrilo je bazično barvilo: njegov obarvani ion nosi pozitiven naboj. Kot pojasnjuje OpenStax v poglavju o barvanju vzorcev, bazična barvila reagirajo z negativno nabitim celičnim materialom in lahko celice poudarijo na svetlejšem ozadju. V ustreznih preparatih metilensko modrilo poudari območja, bogata z nukleinskimi kislinami, in druge strukture, ki vežejo barvilo.

Pri enostavnem barvanju kontrast zagotavlja eno barvilo. Zato je lahko več različnih organizmov videti modrih, ne da bi šlo za isti organizem. Koristna vprašanja so sprva opisna: ali so objekti okrogli ali podolgovati, posamični ali združeni v skupke, enakomerno obarvani ali z razločnimi notranjimi strukturami? Preden barvo razumete kot rezultat razvrščanja, si oglejte razliko med enostavnim barvanjem in barvanjem po Gramu.

Kontrast in ločljivost nista isto. Kontrast pomaga razlikovati objekt od okolice; ločljivost omogoča razločevanje bližnjih podrobnosti. Temnejša slika ne zagotavlja več razločenih struktur. Prav tako vsaka temna granula ne upravičuje oznake organela.

Nativni preparati, obarvani mokri preparati in razmazi

Neobarvan oziroma nativni mokri preparat omogoča opazovanje brez dodanega barvila, čeprav že odvzem iz izvornega okolja spremeni vzorec. Pri obarvanem mokrem preparatu dodamo reagent, medtem ko material ostane v tekočini pod krovnim stekelcem. Pri fiksiranem razmazu material razporedimo po objektnem stekelcu in pred nadaljnjo obdelavo uporabimo določeno metodo fiksacije. OpenStaxov pregled priprave preparatov razlikuje mokre preparate od fiksacije in pojasnjuje, zakaj fiksirani organizmi ne omogočajo več opazovanja običajnega gibanja ali presnove.

Ti preparati odgovarjajo na različna vprašanja:

Za primerjavo pri pouku najprej dokumentirajte neobarvan preparat, nato pa preučite ločeno obarvan preparat, pripravljen po učnem protokolu. Osvetlitev in nastavitve zajema slike naj bodo primerljive. Če fotografirate dve različni celici, ju opišite kot primera, ne kot prikaz iste celice pred barvanjem in po njem.

Mikroskopski atlas: trije resnični obarvani vzorci

Ta atlas je izviren izbor in interpretacija treh mikrografij z odprtimi licencami. Avtorji virov navajajo vzorce in barvila. Njihovih vzorcev nismo neodvisno preverili. Slike so objavljene brez obrezovanja, pretvorjene v WebP brez izgub, brez dodanih elementov ali sprememb barv.

Slika 1: človeške celice ustne sluznice

Vzorec: človeške celice ustne sluznice. Barvilo: metilensko modrilo. Povečava: 400×, kot jo navaja fotograf. Merilna črtica: ni na voljo; vir ne navaja umerjene velikosti slikovne pike. Fotografija: Fritzmann2002, 2017, iz vira Človeške celice ustne sluznice (barvanje z metilenskim modrilom), pod licenco CC BY-SA 4.0. Ta reprodukcija ohranja isto licenco.

Začnite pri osamljeni celici: njeno temnejše jedro je lažje razločiti od okoliške modre citoplazme. Nato preglejte prekrivajoče se celice pod njo. Zaradi prekrivanja je težje slediti meji celice, nastane pa lahko tudi lokalno temnejše območje. To sliko uporabite za vajo sledenja obrisom, ne za štetje vsake temne lise kot jedra. Vodnik za opazovanje celic ustne sluznice podrobneje obravnava vajo za ta vzorec.

Slika 2: celice čebule

Vzorec: celice čebule, kot jih opredeljuje vir. Barvilo: metilensko modrilo. Povečava: v izvirnem imenu datoteke je navedeno »200x«; podatek ni neodvisno potrjen. Merilna črtica: ni na voljo; podatki o umerjanju niso navedeni. Fotografija: Alvy16, 2019, iz vira Celica čebule 200x, pod licenco CC BY 4.0.

Podolgovati celični predeli tvorijo urejeno plast. Primerjajte njihove dolge skupne meje z nepravilnimi obrisi na sliki 1. Opazite tudi izrazit temen material in neenakomerno svetlost vidnega polja. Fotografija ne potrjuje identitete vsake temne usedline. Pokaže, zakaj uporaben zapis opažanj vključuje artefakte in negotovost, namesto da bi poimenovali vse, kar se obarva.

Slika 3: kvasovke, ki jih vir opredeljuje kot Candida spp.

Vzorec: Candida spp., po navedbi fotografinje. Barvilo: enostavno pozitivno barvanje z metilenskim modrilom. Povečava: ni na voljo. Merilna črtica: ni na voljo; umerjena velikost slikovne pike ni navedena. Fotografija: Marta, uporabnica Wikimedie Martunia.g, 2021, iz vira Pozitivno barvanje z metilenskim modrilom 2, pod licenco CC BY 4.0.

Primerjajte goste modre skupke z manj zgoščenimi robnimi predeli. Posameznim obrisom je lažje slediti tam, kjer se objekti manj prekrivajo. Ime Candida izhaja iz zapisa vira, ne iz določanja vrste na podlagi te fotografije. Ta slika prav tako ne podaja rezultata o viabilnosti. Preizkusi viabilnosti in respiracije kvasovk zahtevajo lastne pogoje, kontrole in interpretacijo.

Pravilno razumevanje merila

Te slike omogočajo vizualno primerjavo, ne pa meritev v mikrometrih ali primerjav absolutne velikosti celic med slikami. Navedena povečava ne more nadomestiti manjkajočih podatkov o umerjanju kamere. Spreminjanje velikosti prikaza slike spremeni njeno navidezno povečavo.

Pri lastnih slikah izvedite merilno umerjanje z znanim standardom in ustrezno optično postavitvijo. Nikonov vodnik za mikrometrijo pojasnjuje, kako objektni mikrometer pretvori poljubne razdelke na sliki ali merilni mreži v fizične dolžine. Zabeležite objektiv, konfiguracijo kamere in umerjanje ter na podlagi teh podatkov dodajte merilno črtico. Ne določajte je iz povprečne velikosti celice, navedene v učbeniku.

Ali vsebina stekleničke ustreza metodi?

Steklenička z oznako metilensko modrilo ni popolna laboratorijska specifikacija. Preverite koncentracijo in enote, topilo, dodatne sestavine, predvideno uporabo, dokumentacijo serije in navodila. Varnostni list reagenta opisuje nevarnosti; navodila metode določajo, kako ga uporabiti za predvideni preparat.

Konkreten primer je Merckova Löfflerjeva raztopina metilenskega modrila. Proizvajalec jo opredeljuje kot reagent za mikroskopijo in opisuje njeno vlogo kot kontrastno barvilo pri barvanju kislinsko odpornih mikroorganizmov. Navedena vnetljivost pokaže tudi, zakaj opis »modra tekočina« ne zagotavlja dovolj informacij za načrtovanje ravnanja ali segrevanja. Te lastnosti veljajo za to formulacijo, ne samodejno za vsako vodno raztopino metilenskega modrila.

Podobno je agar z eozinom in metilenskim modrilom formulirano gojišče. Ni barvilo za preparate, ki bi ga pripravili z dodajanjem samega metilenskega modrila vzorcu. Za drugačen cilj slikanja primerjajte alternative metilenskemu modrilu za mikroskopijo.

Pri začetniškem kompletu za mikroskopiranje začnite z dokumentirano učno metodo, znanimi pripravljenimi preparati in predpisanim reagentom. Če steklenička nima več etikete ali njene sestave ni mogoče ugotoviti, jo nadomestite z ustreznim dokumentiranim reagentom. Uporabljajte zaščito za oči in upoštevajte navodila za ravnanje, priložena konkretni formulaciji. Človeški material in neznani vzorci iz okolja zahtevajo postopke učnega laboratorija za ravnanje z vzorci in njihovo odstranjevanje; barvanje teh postopkov ne nadomesti.

Pred sklepom zapišite opažanje

»Modri ovalni objekti v skupkih« je utemeljen opis slike. »Določena okužba« zahteva dokaze, ki jih slika ne zagotavlja. V laboratorijskem dnevniku ločeno zapisujte izvor vzorca, pripravo, reakcijo barvanja in metodo identifikacije. To razlikovanje omogoča uporabnost preproste slike iz učilnice in preprečuje, da bi privlačni mikrografiji pripisovali trditev, ki je ne more podpreti.