Redukčný test metylénovej modrej v bachorovej tekutine

Čerstvá absolventka volá z farmy s modrou skúmavkou v ruke. Pred desiatimi minútami pridala do bachorovej tekutiny metylénovú modrú a modré sfarbenie stále pretrváva. Pýta sa, či má krave podať viac farbiva.

Táto otázka odhaľuje nesprávnu predstavu o teste. Pri redukčnom teste metylénovej modrej v bachorovej tekutine patrí farbivo do skúmavky, nikdy nie do zvieraťa. Celý test prebieha v skúmavke. Meranie času, za ktorý modrá farba zmizne, vypovedá o mikróboch v danej vzorke, nie o liečbe, ktorú zviera potrebuje.

Táto zámena je pochopiteľná, pretože metylénová modrá sa vo veterinárnej praxi objavuje v troch odlišných súvislostiach. Tento článok ich rozlišuje a ukazuje, ako vyhodnocovať čas redukcie spolu s pH, prvokmi, kvalitou odberu a klinickými príznakmi.

Čo test skutočne meria

Metylénová modrá je v oxidovanej forme modrá a v redukovanej forme takmer bezfarebná. Čerstvá bachorová tekutina zdravého zvieraťa má výraznú redukčnú schopnosť, pretože anaeróbne baktérie aktívne fermentujú krmivo. Keď do takejto tekutiny primiešate malé množstvo farbiva, bakteriálny metabolizmus odstráni sfarbenie v priebehu niekoľkých minút.

Princíp testu je teda jednoduchý: aktívna anaeróbna mikroflóra odfarbí modrú rýchlo, neaktívna alebo poškodená mikroflóra pomaly. Krátky čas znamená väčšiu redukčnú schopnosť danej vzorky. Predĺžený čas poukazuje na utlmenú mikrobiálnu aktivitu, ak bola vzorka správne odobratá a spracovaná.

Test nemeria redoxný potenciál bachora priamo. Štúdia metód u hovädzieho dobytka, ktorá porovnávala redukčný test s priamymi meraniami v milivoltoch, nezistila lineárnu koreláciu medzi časom redukcie a nameraným redoxným potenciálom. Dospela k záveru, že tieto dve merania nemožno považovať za zameniteľné údaje o tej istej veličine. Úplné porovnanie je zhrnuté na stránke PubMed. Redukčný test vnímajte ako funkčný test mikrobiálnej populácie, nie ako lacnú náhradu elektródy.

Opis jednoduchej indigescie u prežúvavcov v príručke Merck/MSD zaraďuje predĺžený čas redukcie do rovnakého súboru nálezov ako abnormálne pH bachora a znížený počet prvokov. Žiadna jednotlivá hodnota neurčuje diagnózu. Rozhoduje súbor nálezov.

Štandardný postup pri zvierati

Protokoly sa medzi školami mierne líšia, preto zaznamenajte presné objemy a teplotu, ktoré používate, a porovnávajte výsledky len v rámci toho istého protokolu. Jeden bežne vyučovaný variant je:

Odoberte aspoň 10 až 20 mL čerstvej bachorovej tekutiny s minimálnou prímesou slín, minimálnym vystavením vzduchu a minimálnym ochladením. Test vykonajte bezodkladne.
Pripravte 0.03 percentný roztok metylénovej modrej, čo zodpovedá 0.3 mg na mL.
Pridajte farbivo v množstve 5 percent objemu tekutiny. To znamená 1.0 mL farbiva do 20 mL tekutiny alebo 0.5 mL farbiva do 10 mL tekutiny. V oboch prípadoch je pomer tekutiny k farbivu rovnaký, 20 ku 1.
Druhú skúmavku s tekutinou z tej istej vzorky bez pridaného farbiva ponechajte ako farebnú kontrolu.
Jemne premiešajte, ihneď spustite časomer a udržiavajte skúmavku pri teplote blízkej telesnej teplote, približne 37 až 39 stupňov Celzia podľa miestneho protokolu.
Zaznamenajte čas, za ktorý sa farba testovanej vzorky zhoduje s kontrolou. Na rozhraní so vzduchom môže pretrvávať tenký modrý prstenec, pretože kyslík tam farbivo znovu oxiduje. Na zmiznutie tohto prstenca nečakajte.

Redoxná chémia metylénovej modrej vysvetľuje, prečo je tu kyslík dôležitý. Prudké pretrepávanie, široko otvorená skúmavka alebo dlhé čakanie umožňujú prístup kyslíka a udržiavajú farbivo modré dlhšie, než by zodpovedalo podmienkam v samotnom bachore. Z rovnakého dôvodu záleží na detailoch techniky odberu bachorovej tekutiny bez kontaminácie. Sliny vzorku riedia a zvyšujú pH, preto mnohí veterinári pri odbere žalúdočnou sondou prvú časť tekutiny zlikvidujú, ak to dostupný objem umožňuje.

Čo merajú jednotlivé pozorovania

Čas redukcie odpovedá len na jednu otázku. Nasledujúci prehľad hodnotenia bachora ukazuje, čím prispieva každé pozorovanie pri zvierati. Posudzujte celý riadok, nie jedinú bunku.

Pozorovanie	Čo meria	Typický nález pri zvierati	Bežné skresľujúce faktory
Čas redukcie metylénovej modrej	Funkčnú redukčnú aktivitu anaeróbnych baktérií vo vzorke	U hovädzieho dobytka často 2 až 6 minút; u oviec a kôz často kratšie, pričom 6 minút sa používa ako praktická hranica primeranej aktivity a časy nad 10 minút sú výrazne abnormálne	Studená, neskoro testovaná, prevzdušnená alebo slinami zriedená vzorka; málo substrátu po dlhodobom nechutenstve; perorálne antimikrobiálne lieky; porovnávanie pri rôznych pomeroch farbiva alebo teplotách
pH bachora	Chemické prostredie, kyslú alebo zásaditú záťaž	U hovädzieho dobytka kŕmeného objemovým krmivom často okolo 6.0 až 7.2; texty o malých prežúvavcoch často uvádzajú približne 6.5 až 7.5; kŕmna dávka a čas od kŕmenia hodnotu posúvajú	Kontaminácia slinami zvyšuje pH vzoriek odobratých žalúdočnou sondou; únik oxidu uhličitého po odbere; kŕmenie obilninami znižuje pH
Počet a pohyblivosť prvokov	Stav populácie nálevníkov, najmä veľkých foriem citlivých na narušenie	Množstvo organizmov rôznych veľkostí s intenzívnym pohybom určitým smerom v teplej čerstvej kvapke	Ochladenie spomaľuje pohyb; ťažká acidóza môže prvoky úplne eliminovať; oneskorenie spôsobuje, že normálna vzorka vyzerá málo aktívna
Zápach, farba a konzistencia	Charakter fermentácie a kontamináciu	Mierne aromatická, zelenohnedá, mierne viskózna tekutina	Hnilobný alebo kyslý zápach pri ťažkej dysbióze; vodnatá tekutina alebo tekutina s veľkou prímesou slín po nekvalitnom odbere
Kontrakcie bachora a chuť do žrania	Funkciu predžalúdkov a príjem krmiva na úrovni celého zvieraťa	Pravidelné kontrakcie a sústavné prežúvanie u čulého zvieraťa	Nedávna zmena kŕmnej dávky, bolesť, dehydratácia, systémové ochorenie

Podstatný je celkový obraz v tabuľke. Predĺžený čas redukcie spolu s málo pohyblivými prvokmi, abnormálnym pH a slabými kontrakciami poukazuje na skutočné utlmenie mikrobiálnej aktivity. Izolovane predĺžený čas u čulého, prežúvajúceho zvieraťa s aktívnymi prvokmi poukazuje skôr na problém so vzorkou než s bachorom. Pred ďalším postupom odber zopakujte.

Vyhodnotenie času spolu s pH a anamnézou

Východiskový stav určuje kŕmna dávka. Dávky bohaté na jadrové krmivá rýchlo fermentujú a môžu odfarbiť farbivo približne za minútu, zatiaľ čo pri kŕmení senom to môže trvať niekoľko minút aj u zdravých zvierat. Krátky čas teda sám osebe nedokazuje lepší zdravotný stav. Dokazuje, že viac fermentovateľného substrátu prišlo do kontaktu s aktívnymi mikróbmi.

Ťažké preťaženie obilninami tento jednoduchý trend narúša. Počiatočná fermentácia sacharidov môže byť intenzívna, potom však poškodenie kyselinami potlačí normálnu mikroflóru a prvoky a čas redukcie sa predĺži. Preto jedno z pravidiel používaných pri výučbe uvádza, že test nie je platný pri pH bachora pod približne 5.5. V tomto stave je už testovaná mikroflóra zmenená.

Praktický prehľad súvislostí:

Normálne pH s redukciou do približne 6 minút naznačuje funkčne aktívnu mikroflóru.
Normálne pH s výrazne predĺženou redukciou naznačuje neaktivitu v dôsledku nechutenstva, účinku antimikrobiálnych liekov alebo znehodnotenej vzorky.
Vysoké pH s predĺženou redukciou často nasleduje po dlhodobom nechutenstve s nedostatkom substrátu, zvážte však aj kontamináciu slinami pri odbere sondou.
Nízke pH so zníženou aktivitou prvokov vyvoláva podozrenie na dysbiózu súvisiacu so sacharidmi. Pomôžu tu odporúčania na interpretáciu pH bachora. Hodnoty pod 5.5 spolu s celkovým útlmom poukazujú skôr na preťaženie obilninami a ťažkú acidózu než na jednoduchú indigesciu.

Vždy zaznamenajte nedávne perorálne podanie tetracyklínov, ionofory v krmive, dlhodobé podávanie systémových antimikrobiálnych liekov, náhle zmeny kŕmnej dávky, trvanie nechutenstva a príjem vody. Príručka MSD výslovne upozorňuje, že perorálne tetracyklíny môžu výrazne potlačiť bachorovú mikroflóru. Ionofory cielene menia zloženie bakteriálnych populácií. Bez tejto anamnézy sa predĺžený čas nedá interpretovať.

Rovnakú váhu si zaslúži kvalita odberu. Kontrolovaný výskum zistil, že vzorky odobraté žalúdočnou sondou mali vyššie pH a nižší obsah prchavých mastných kyselín než vzorky odobraté kanylou z tých istých zvierat, najmä v dôsledku prímesi slín. Po 60 minútach od odberu sa čas redukcie významne predĺžil pri každom testovanom objeme, pričom najviac boli ovplyvnené malé vzorky. Odoberte aspoň 10 mL, testujte do 30 minút, redukčný test vykonajte medzi prvými, udržiavajte vzorku teplú a minimalizujte kontakt so vzduchom.

Tri použitia, ktoré sa nesmú zamieňať

Rovnaké farbivo, tri rôzne systémy.

Prvým je tu opísaný test bachorovej tekutiny. Vzorkou je odobratá bachorová tekutina. Farbivo sa pridáva in vitro v koncentrácii 0.03 percenta. Koncovým bodom je čas do odfarbenia. Účelom je posúdenie mikrobiálnej redukčnej aktivity.

Druhým je podanie metylénovej modrej živému prežúvavcovi. Zavedeným príkladom je intravenózna liečba intoxikácie dusičnanmi alebo dusitanmi s methemoglobinémiou, pri ktorej liečivo obnovuje funkčný hemoglobín. Platia pravidlá týkajúce sa dávky, liekovej formy, rezíduí a ochranných lehôt. Toto rozhodnutie nijako nesúvisí s meraním času v skúmavke. Ak sa farbivo používa in vivo ako stopovacia látka pri konkrétnom postupe, podstatné je, kam sa dostáva, nie ako rýchlo ho bachorové mikróby redukujú.

Tretím je redukčný test mlieka. Vzorkou je mlieko. Farbivo sa pridáva do vzorky mlieka. Rýchle vymiznutie modrej farby vo všeobecnosti naznačuje vyššiu mikrobiálnu aktivitu a horšiu trvanlivosť, zatiaľ čo pomalá redukcia naznačuje lepšiu kvalitu. Patrí do potravinárskej mikrobiológie a testovania kvality mlieka, nie do diagnostiky bachora, a nejde o stanovenie počtu baktérií.

Presné pomenovania predchádzajú chybám: čas redukcie v bachorovej tekutine, systémová liečba metylénovou modrou alebo jej použitie ako stopovacej látky a redukčný test mlieka. Bezpečnostné pravidlo sa zmestí do jednej vety. Farbivo určené na test bachorovej tekutiny zostáva v laboratórnej skúmavke a táto skúmavka sa po teste zlikviduje. Na vykonanie testu sa nikdy nepodáva zvieraťu.

Stručné pravidlo pre telefonát z farmy

Štandardizujte farbivo na 0.03 percenta a pomer 1 diel farbiva k 20 dielom tekutiny, testujte čerstvú tekutinu pri teplote blízkej telesnej teplote oproti kontrole bez pridaného farbiva a nameraný čas v minútach vyhodnocujte spolu s pH, pohyblivosťou prvokov, kvalitou odberu, kŕmnou dávkou, liekmi, kontrakciami, chuťou do žrania, výkalmi a hydratáciou. Izolované číslo nikdy neurčuje diagnózu indigescie. Rozhoduje súlad nálezov.