Metylénová modrá vo výskume dania pruhovaného: chovateľská prísada a faktor skresľujúci experiment

Voda pre ikry dania pruhovaného býva často jemne modrá a takmer nikto nezaznamenáva prečo. Farbivom je metylénová modrá, pridávaná proti plesniam, a väčšina protokolov ju považuje za súčasť pozadia. Pozadie je tu však nesprávny pojem. Výstižnejšie je hovoriť o neuvedenom experimentálnom faktore: o látke prítomnej v exponovaných miskách a neprítomnej v kontrolách, ktorá je pri používaných koncentráciách farmakologicky aktívna a dokáže meniť práve tie sledované ukazovatele, ktoré experiment meria.

Toto rozlíšenie je základom všetkého, čo nasleduje. Bežná protiplesňová starostlivosť pri chove je jedna otázka. To, či je prísada neutrálna vo vzťahu k vášmu testu, je otázka iná. Nedávna literatúra o daniu pruhovanom odpovedá na prvú upokojujúco a na druhú znepokojivo.

Čo usmernenia skutočne predpisujú

Neexistuje jednotný štandard, čo je súčasťou problému. Usmernenie Kanadskej rady pre starostlivosť o zvieratá povoľuje 0.5 mg/L, teda 0.00005%, v roztoku na prepravu ikier a lariev na obmedzenie rastu plesní. Európske usmernenie pre laboratórne zvieratá opisuje embryá udržiavané v médiu, ktoré často obsahuje rovnakých 0.00005%. Receptúra média E3 z Cold Spring Harbor uvádza ako zložku dvojnásobok, 1 mg/L čiže 0.0001%. Oproti tomu stojí nápadné vynechanie: usmernenie OECD pre test toxicity na rybích embryách predpisuje rekonštituovanú riediacu vodu a testovanú chemickú látku, no odporúčanie používať metylénovú modrú neobsahuje ani verzia z roku 2013, ani neskoršia revízia. Jedno laboratórium tak odchováva embryá dania pruhovaného v modrej vode s metylénovou modrou od prvých hodín života, druhé vykonáva regulačný test na embryách v čírej vode a obe označujú svoje médium za normálne. Každý, kto porovnáva výsledky medzi laboratóriami alebo spája historické kontroly, preberá aj túto nejednotnosť.

Pre predstavu o koncentráciách: 0.00005% je približne 1.56 mikromolárnej koncentrácie a 0.0001% približne 3.13 mikromolárnej koncentrácie. Sú to nízke hodnoty a je lákavé považovať ich za príliš nízke na to, aby mali význam. Nižšie uvedené štúdie overujú presne tento predpoklad, a to pri presne týchto koncentráciách.

Čitatelia z prostredia akvaristiky, nie laboratória, sa s rovnakou molekulou stretávajú v inom kontexte, opísanom v akvaristickom sprievodcovi metylénovou modrou. Chémia je rovnaká; opis toho, ako farbivo prenáša elektróny v bunkách, vysvetľuje, prečo sa redoxne aktívna zlúčenina opakovane objavuje v prácach o metabolizme. Nasledujúci text sa týka konkrétne vody pre ikry dania pruhovaného s metylénovou modrou.

Metabolizmus: smer účinku sa mení podľa štádia

Najinformatívnejšia štúdia vystavila normálne sa vyvíjajúce daniá pruhované metylénovej modrej od prvého dňa života až do 5 dní po oplodnení a merala oxidačný metabolizmus v každom štádiu, ako opisuje publikovaná správa o experimentoch s metabolizmom embryí. Tento priebeh si zaslúži presný opis, pretože mení smer.

1 deň po oplodnení sa u exponovaných embryí zvýšila bazálna spotreba kyslíka pri oboch chovateľských koncentráciách. Po 2 dňoch bol mitochondriálny membránový potenciál v povrchovej vrstve lariev zvýšený pri expozíciách 0.00005%, 0.0001% aj 0.0003%. Do 4 až 5 dní, po vyliahnutí, sa smer obrátil: oxidačný energetický výdaj klesol, či už expozícia prebiehala nepretržite od oplodnenia, alebo akútne iba od 3. do 4. dňa. Súbežne sa po 1 aj 4 dňoch znížilo množstvo transkriptov podjednotiek mitochondriálnych respiračných komplexov spolu s transkriptmi súvisiacimi so steroidogenézou a glukoneogenézou.

Obraz spresňujú ďalšie dve pozorovania. Pri vyššej chovateľskej koncentrácii prebiehalo liahnutie mierne skôr: po 2 dňoch boli exponované embryá popredu a do 3. dňa ich kontroly dobehli. Samotná stresová os sa pritom javila ako neporušená: keď boli 5-dňové larvy vystavené stresoru v podobe vírenia, celotelová hladina kortizolu sa v oboch skupinách normálne zvýšila. Farbivo teda pri týchto dávkach nie je všeobecným vývojovým jedom a nepotláča každú fyziologickú reakciu. Mení energetický metabolizmus v závislosti od štádia: pred vyliahnutím ho zvyšuje a po vyliahnutí znižuje.

Správanie: prečo sa dve štúdie nezhodujú a prečo môžu mať obe pravdu

Literatúra o správaní pôsobí rozporne, kým sa vedľa seba neporovnajú usporiadania expozície. Jedna štúdia vývojovej a behaviorálnej bezpečnosti vystavila embryá od približne 6 hodín po oplodnení koncentráciám až do 10 mikromolárnej koncentrácie, denne obnovovala roztoky až do 4. dňa, potom presunula larvy na 5. a 6. deň do média bez farbiva a na 6. deň testovala lokomóciu v teste so striedaním svetla a tmy. Výsledok: žiadny významný vplyv na úmrtnosť, liahnutie či morfológiu a žiadny účinok expozície na lokomóciu. Autori odôvodnene odporučili 10 mikromolárnu koncentráciu ako hornú hranicu za svojich podmienok.

Druhá skupina, ktorej autori sa čiastočne prekrývali s autormi metabolickej štúdie, uskutočnila expozíciu spôsobom zodpovedajúcim skutočnému chovu: farbivo bolo prítomné od 2 až 3 hodín po oplodnení, s každodennou čiastočnou výmenou, a správanie sa meralo počas prebiehajúcej expozície alebo krátko po nej. Pri rovnakých bežných koncentráciách vykazovali larvy zníženú lokomóciu v 24-hodinovom teste, čo sa podarilo zopakovať pri rôznych kmeňoch a v rôznych laboratóriách. Štúdia skresľovania behaviorálnych výsledkov spojila účinok so serotonergným tonusom, čo je v súlade so známou inhibíciou monoaminooxidázy týmto farbivom. Najvýpovednejšie bolo, že médium pre embryá obsahujúce metylénovú modrú maskovalo očakávanú lokomotorickú reakciu na fluoxetín zo skupiny SSRI. Skríningový test vykonaný v modrej vode preto môže prehliadnuť účinok liečiva, ktorý by číra voda odhalila.

Skutočný rozpor tu nie je. Zlúčenina nemusí v jednom teste zanechať žiadny zistiteľný zvyškový účinok dva dni po odstránení z média, a pritom môže byť v inom teste stále aktívna, kým je prítomná. Praktický záver je, že nulový výsledok podporuje hornú hranicu koncentrácie, nie tvrdenie o neutralite, zatiaľ čo pozitívny výsledok opisuje podstatné riziko: prebiehajúcu expozíciu počas merania, a to presne v usporiadaní, ktoré používa väčšina laboratórií.

Redoxné farbivo v redoxnom teste

Ďalšia nástraha si zaslúži samostatný odsek, pretože skresľuje samotnú metódu merania, nie zviera. Test energetického výdaja Alamar Blue je sám založený na redoxnej chémii: rezazurín sa redukuje na fluorescenčný rezorufín. Aj metylénová modrá sa zúčastňuje redoxných reakcií. V bezbunkových kontrolách obe chovateľské koncentrácie po 24 hodinách mierne, ale významne znížili fluorescenciu Alamar Blue. V experimentoch na zvieratách boli exponované embryá pred testom premyté najmenej trikrát v médiu bez farbiva a biologický účinok u vyliahnutých lariev prevyšoval bezbunkovú interferenciu. Platí teda oboje: premyté zvieratá vykazujú skutočný metabolický účinok a nevymyté farbivo k nemu pridáva priamy chemický artefakt. Kontroly musia tieto dva javy oddeliť, inak ani jedna hodnota nič neznamená. Všeobecné odporúčania k interpretácii výsledkov testov založených na farbivách tu platia obzvlášť dôrazne.

Časový prehľad vývojových štádií

Pôvodný prehľad vytvorený pre tento článok. Ak nie je uvedené inak, koncentrácie zodpovedajú dvom štandardným chovateľským hodnotám, 0.00005% a 0.0001%.

Treba si zapamätať skorý nárast a neskorší pokles metabolických ukazovateľov, pričom účinky na správanie sú prítomné počas expozície a po odstránení látky z organizmu nezistiteľné v jedinom teste, ktorý to skúmal.

Kontrolný zoznam pre návrh kontrol

Druhý pôvodný podklad. Použite ho, keď sa protokoly pre danio pruhované využívajúce metylénovú modrú prepoja s experimentom.

1. Uvádzajte farbivo ako činidlo, nie ako vodu. Uveďte koncentráciu v percentách aj ako mikromolárnu koncentráciu, začiatok a koniec expozície v hodinách alebo dňoch po oplodnení, harmonogram výmen a interval vymývania pred každým meraním.
2. Prispôsobte kontroly výskumnej otázke. Štúdia testovanej chemickej látky potrebuje kontroly bez farbiva; štúdia chovateľských postupov potrebuje skupinu bez farbiva aj skupinu s farbivom, pričom sa musí zaznamenať protiplesňový výsledok, keďže ani jedna z citovaných štúdií nemerala protiplesňovú účinnosť.
3. Pred redoxnými testami premyte a potom overte výsledok. Premyte najmenej trikrát v médiu bez farbiva a súbežne vykonajte bezbunkovú kontrolu s farbivom a činidlom, pretože farbivo priamo znižuje signál Alamar Blue.
4. Ukazovatele správania a monoamínov považujte za vysoko rizikové. Štúdie lokomócie, úľakovej reakcie, správania podobného úzkosti, antidepresív a inhibítorov MAO by sa mali počas merania vyhnúť farbivu alebo preukázať jeho neutralitu pre konkrétny sledovaný ukazovateľ; vymývanie počas jedného až dvoch dní odstránilo jeden lokomotorický účinok, no pre iné experimentálne usporiadania to nie je preukázané.
5. Metabolické a mitochondriálne ukazovatele považujte za vysoko rizikové v každom štádiu. Spotreba kyslíka, energetický výdaj, membránový potenciál a transkripty dýchacieho reťazca sa pri chovateľských koncentráciách menia, a to opačným smerom pred vyliahnutím a po ňom.
6. Neprenášajte neutralitu medzi rôznymi usporiadaniami. Nulový výsledok po vymytí neplatí pre prebiehajúcu expozíciu; nulový morfologický výsledok neplatí pre metabolizmus ani interakciu s liečivom; výsledok pri jednom kmeni, teplote alebo trvaní testu neplatí pre ostatné.
7. Uveďte usmernenie, ktorým ste sa riadili, aj jeho alternatívu. Výslovne pomenujte koncentrácie podľa CCAC, európskeho usmernenia alebo Cold Spring Harbor a upozornite na to, kde embryonálny test OECD farbivo vynecháva, aby čitateľ vedel zaradiť podmienky, v ktorých boli vaše zvieratá chované.

Nič z toho nehovorí proti používaniu farbiva na udržanie ikier nažive. Hovorí to proti tomu, aby sa chovateľské rozhodnutie bez preskúmania premietlo do údajov. Modrá farba v miske je molekula s farmakologickými vlastnosťami a experimenty s najvyšším rizikom skreslenia sú práve vysokokapacitné metabolické a neurobehaviorálne skríningy, pri ktorých sa dnes uprednostňujú mladé daniá pruhované. Zaznamenajte ju, zahrňte ju do kontrol, pred meraním ju vymyte a overte test, do ktorého sa môže nenápadne zapájať.