Metylénová modrá v laboratórnych testoch G6PD: akú úlohu farbivo skutočne plní

Študent po inkubácii pozoruje dve skúmavky. Jedna získala očakávanú farbu. Druhá nie. Študent usúdi, že druhý pacient má deficit glukóza-6-fosfátdehydrogenázy. Tento záver môže byť správny, no v jeho uvažovaní chýba princíp, na ktorom test funguje. Nič v skúmavke nemeria enzým priamo. V skúmavke sa meria to, čo enzým vytvára, pričom metylénová modrá slúži ako sprostredkovateľ.

Keď je tento nepriamy princíp jasný, postup, kontroly aj dlhý zoznam falošných výsledkov prestanú pôsobiť svojvoľne.

Stručná odpoveď

Metylénová modrá je pri testovaní G6PD redoxným indikátorom. Enzým G6PD vytvára NADPH a systémy závislé od NADPH redukujú modrú metylénovú modrú na jej bezfarebnú leukoformu alebo ju využívajú na prenos elektrónov. Normálna aktivita enzýmu vedie k účinnej redukcii. Nedostatočná aktivita vedie k pomalej alebo neúplnej redukcii. To je celý meraný signál.

Dve historické metódy používajú rovnaké farbivo, ale líšia sa sledovaným výsledkom. Ak ich budete rozlišovať, väčšina nejasností zmizne.

Dva testy, jedno farbivo, odlišné výsledné sfarbenie

Prvým je priamy test redukcie metylénovej modrej, ktorý opísali Sass a kolegovia a neskôr vyhodnotil Gibbs. Tu sa sleduje samotné farbivo: oxidovaná modrá metylénová modrá sa redukuje na bezfarebnú leukometylénovú modrú a rýchlosť tejto zmeny odráža schopnosť vytvárať NADPH. Pôvodná práca o skríningu je indexovaná v databáze PubMed ako Sass a kol. (1966).

Druhým je Brewerov test redukcie methemoglobínu. Dusitan sodný najprv oxiduje hemoglobín na hnedý methemoglobín. Metylénová modrá potom pôsobí ako mediátor prenosu elektrónov: redukovaná metylénová modrá odovzdáva methemoglobínu redukčné ekvivalenty a premieňa ho späť na červený hemoglobín. Viditeľným výsledkom je teda hnedé alebo červené sfarbenie, nie modré alebo bezfarebné. Pôvodná metóda bola publikovaná v časopise Bulletin Svetovej zdravotníckej organizácie (Brewer a kol., 1960).

Označovať Brewerov test za test odfarbovania farbiva je z chemického hľadiska nepresné. Farbivo cyklicky mení svoj oxidačno-redukčný stav; farbu mení hemoglobín. Nasledujúca schéma znázorňuje obe dráhy.

Základná reakcia

G6PD katalyzuje prvý oxidačný krok pentózofosfátovej dráhy:

Glukóza-6-fosfát + NADP+ sa mení na 6-fosfoglukonolaktón + NADPH + H+

Zrelé červené krvinky sú pri tvorbe NADPH do veľkej miery závislé od tejto dráhy, ako uvádza prehľad Luzzatta a kolegov v časopise Blood (2020). NADPH udržiava glutatión v redukovanom stave a chráni bunku pred oxidačným poškodením. Metylénová modrá vstupuje do tohto systému ako akceptor elektrónov. Dostatočná aktivita G6PD zabezpečuje dostatok NADPH, ktorý umožňuje účinnú redukciu. Nízka aktivita G6PD prerušuje tento reťazec už pri prvom článku.

Predstavte si farbivo ako palivomer, nie ako motor. Informuje o dostupnosti NADPH. Čokoľvek iné, čo ovplyvní túto dostupnosť alebo odčítanie výsledku, môže pohnúť ručičkou bez akejkoľvek zmeny génu.

Ako prebieha postup podľa Brewerovej metódy

Zloženie reagencií sa v priebehu desaťročí menilo, preto si opis na výučbové účely nemožno zamieňať s klinickým protokolom. Každé laboratórium sa riadi vlastným validovaným štandardným pracovným postupom. S týmto upozornením klasický skúmavkový test prebieha nasledovne, vo variante s tromi skúmavkami a 3-hodinovou inkubáciou zdokumentovanom v tomto publikovanom postupe:

1. Skúmavka s pacientovou vzorkou: plná krv s glukózou, dusitanom sodným a metylénovou modrou. Dusitan vytvára methemoglobín, glukóza podporuje metabolizmus červených krviniek a farbivo zabezpečuje prenos elektrónov závislý od NADPH.
2. Oxidovaná kontrola: krv s dusitanom a glukózou, ale bez metylénovej modrej. Ukazuje hnedé sfarbenie methemoglobínu, ktoré zodpovedá deficitu.
3. Hemoglobínová kontrola: krv s vodou. Ukazuje červené sfarbenie hemoglobínu, ktoré zodpovedá normálnemu výsledku.
4. Inkubujte všetky skúmavky pri teplote približne 37 C, zvyčajne 3 hodiny, a jemne ich premiešavajte.
5. Zrieďte malý alikvotný podiel z každej skúmavky destilovanou vodou, aby sa bunky lyzovali a farby sa dali dobre porovnať.
6. Porovnajte skúmavku s pacientovou vzorkou s oboma kontrolami. Návrat k červenému sfarbeniu naznačuje značnú redukčnú kapacitu. Pretrvávajúce hnedé sfarbenie naznačuje výrazný deficit.

Jedno historické zloženie používalo približne 1 mL krvi s reagenciami s koncentráciami približne 180 mM dusitanu sodného, 280 mM dextrózy a 0.4 mM metylénovej modrej. Tieto čísla považujte za príklad z literatúry, nie za univerzálnu špecifikáciu.

Odčítanie výsledku

Kvalitatívny skríning najlepšie rozlišuje výsledky pri aktivite približne 30 až 40 percent normálnej hodnoty, ako sa uvádza v tomto prehľade nedostatkov v detekcii G6PD v časopise Malaria Journal. Normálny výsledok skríningu preto znamená, že test nezachytil závažný deficit. Nepotvrdzuje úplne normálnu aktivitu.

Prečo môže skríning zavádzať

Retikulocytóza po hemolýze je klasickou príčinou falošne normálneho výsledku. Mladé červené krvinky a retikulocyty obsahujú viac G6PD než staré bunky. Počas akútnej hemolytickej epizódy už môžu byť najstaršie bunky s najvýraznejším deficitom zničené, takže zostane mladá populácia, ktorej aktivita pri testovaní vychádza ako normálna. Tento biologický jav skresľuje aj kvantitatívne vyšetrenia, nielen skríningové testy s farbivom.

Nedávna transfúzia maskuje deficit, pretože červené krvinky darcu prispievajú do vzorky vlastným enzýmom. Mayo Clinic Laboratories uvádza transfúziu medzi príčinami nespoľahlivých výsledkov vyšetrenia enzýmu spolu s retikulocytózou a interferenciou leukocytov.

Heterozygotné ženy predstavujú najnáročnejší prípad. Náhodná inaktivácia chromozómu X vytvára zmes normálnych a deficitných červených krviniek a celková aktivita môže siahať od výrazne zníženej až po zdanlivo normálnu. Kvalitatívne skríningové testy často nezachytia intermediárne fenotypy. Dokumentácia WHO o testovaní G6PD toto obmedzenie podrobne rozoberá.

Vek vzorky, teplota skladovania, subjektivita vizuálneho hodnotenia výsledného sfarbenia, hematokrit a kvalita reagencií pridávajú k týmto biologickým vplyvom ďalší analytický šum.

Skríning nie je diagnóza

Deficitný, intermediárny alebo s klinickým obrazom nezhodný výsledok skríningu si vyžaduje kvantitatívne vyšetrenie aktivity enzýmu G6PD. WHO považuje kvantitatívnu spektrofotometriu pri kontrolovanej teplote za referenčný prístup. Pri tomto vyšetrení sa do hemolyzátu červených krviniek pridáva glukóza-6-fosfát a NADP+ a vznikajúci NADPH sa sleduje podľa nárastu absorbancie pri 340 nm. Rýchlosť zmeny je úmerná aktivite enzýmu, zvyčajne normalizovanej na hemoglobín a vyjadrenej v jednotkách na gram. Súčasnú prax klinických laboratórií sumarizuje položka katalógu vyšetrení Mayo pre aktivitu G6PD.

Pri interpretácii sa používa referenčné rozmedzie validované laboratóriom, často vyjadrené vo vzťahu k normálnej aktivite v populácii, pričom deficit sa bežne posudzuje pri prahovej hodnote okolo 30 percent a intermediárna aktivita nad ňou. Tento diagnostický rámec opisujú cieľové produktové profily WHO pre testy G6PD (2022). Ak nedávna hemolýza alebo transfúzia spôsobuje nespoľahlivosť fenotypizácie, testovanie zopakujte po opätovnom ustálení populácie červených krviniek. Molekulové testovanie môže doplniť informácie, no nenahrádza meranie aktivity enzýmu.

Hranica, ktorú treba zachovať

Metylénová modrá je v týchto testoch laboratórnou reagenciou používanou ex vivo. Táto skutočnosť patrí do inej diskusie než bezpečnosť podávania metylénovej modrej pacientovi, ktorou sa zaoberá prehľad kontraindikácií metylénovej modrej. Biochémia ich spája, pretože aj liečivo závisí od redukcie sprostredkovanej NADPH, no farbivo v skúmavke nie je dávka v krvnom obehu. Kontext o tom, ako sa farbivo správa pri farbení v inom prostredí, nájdete v článku o princípoch farbenia metylénovou modrou. O chemickej skupine, do ktorej patrí, pojednáva téma redoxných farbív v laboratóriu.

Skríning skúma, či sa redukčná kapacita javí ako zachovaná. Potvrdzujúce vyšetrenie zisťuje, koľko enzýmu je skutočne prítomného. Farbivo dobre poslúži pri prvej otázke, pokiaľ od neho nikto neočakáva odpoveď na druhú.