Testy kvasiniek s metylénovou modrou: počítanie živých buniek verzus meranie času respirácie

Na laboratórnom stole stoja dve skúmavky. Obe sú modré. V jednej modré bunky pod mikroskopom znamenajú mŕtve kvasinky. V druhej prechod skúmavky z modrej na bezfarebnú znamená, že kvasinky sú živé a respirujú. Rovnaké farbivo, opačná interpretácia. Ak si tieto dva testy pomýlite, každý záver sa obráti.

Práve tomuto rozdielu sa venuje celý článok. Metylénová modrá je redoxné farbivo: v oxidovanej forme je modrá, v redukovanej forme je to bezfarebná leukometylénová modrá. Počítanie životaschopných buniek využíva túto chémiu pri krátkom mikroskopickom pozorovaní. Respiračný experiment ju využíva pri časovo sledovanej reakcii v celom objeme vzorky. Každý test potrebuje vlastný protokol, vlastné kontroly a vlastný kritický prístup.

Počítanie životaschopných buniek: krátke farbenie, rýchle vyhodnotenie

Najštandardizovanejšou verziou je protokol používaný v pivovarníctve. Pripravte 0.01% w/v metylénovú modrú v 2% citráte sodnom, zmiešajte ju v pomere 1:1 so suspenziou kvasiniek a zmes vyšetrite po krátkom, pevne stanovenom intervale. Publikované intervaly sa pohybujú od 1 do 2 minút v príručke Brewing Science Institute po približne 5 minút vo výskumných protokoloch, pričom metóda OIV pre mikrobiológiu vína vyžaduje vyšetrenie do 10 minút. Konečná koncentrácia farbiva v zmesi na počítanie je približne 0.005%. Naplňte vylepšenú Neubauerovu komôrku a pri zväčšení približne 400x klasifikujte tmavomodré bunky ako neživotaschopné a nezafarbené bunky ako životaschopné. Svetlomodré bunky sa v metóde OIV hodnotia ako živé, čo už naznačuje problém subjektivity rozoberaný nižšie.

Koncentrácia buniek sa vypočíta z geometrie komôrky. Keď sa spočíta celý centrálny štvorec so stranou 1 mm, počet buniek na mL sa rovná N krát faktor riedenia krát 10^4, kde N je počet buniek v tejto oblasti, ako uvádzajú metódy ASBC pre kvasinky. Životaschopnosť sa počíta jednoduchšie: počet nezafarbených buniek vydelený celkovým počtom buniek, krát 100. Na odhad životaschopnosti spočítajte približne 400 buniek podľa porovnávacej pivovarníckej štúdie FEMS a praxe OIV. Dôsledne používajte jedno pravidlo pre bunky na hraniciach, napríklad započítavajte bunky na spodných a ľavých čiarach mriežky a vynechávajte tie na horných a pravých.

Pravidlo pre púčiky treba stanoviť ešte pred začiatkom počítania. Podľa bežnej konvencie sa púčik počíta ako samostatná bunka, keď dosiahne približne polovicu veľkosti materskej bunky; menší púčik sa počíta spolu s materskou bunkou. Nech zvolíte akékoľvek pravidlo, uplatňujte ho v každom štvorci a zapíšte ho do pracovného listu, aby ho ďalšia osoba použila rovnako.

Pracovný list na počítanie (vytlačte si ho)

Tento pracovný list je pôvodný materiál vytvorený pre tento článok. Prepíšte si ho do zošita alebo vytlačte jeden pre každú vzorku.

Životaschopnosť (%) = 100 x nezafarbené / (nezafarbené + tmavomodré). Celkový počet buniek na mL = N x faktor riedenia x 10^4, pričom N pochádza z určenej oblasti komôrky. Vedľa výsledku zaznamenajte interval farbenia, pretože údaj o životaschopnosti bez časového údaja nie je reprodukovateľný.

Prečo sa hodnoty životaschopnosti menia

Prvým rušivým vplyvom je čas a pôsobí oboma smermi. Metabolicky aktívne bunky redukujú farbivo, takže pri príliš skorom vyhodnotení možno zachytiť živé bunky skôr, než ho stihnú zredukovať, a nesprávne ich klasifikovať ako mŕtve. Dlhodobá expozícia je však sama osebe toxická a vytvára skutočne poškodené modré bunky, čo vedie k falošnému zafarbeniu indikujúcemu smrť. Laboratórny výučbový protokol preto stanovuje vyhodnotenie do 5 minút, ako dokumentuje wisconsinský výučbový protokol pre kvasinky. Spoľahlivo možno povedať, že hodnotenie s metylénovou modrou závisí od času, preto si stanovte jeden krátky interval a dodržujte ho pri každej vzorke v sérii.

Vzorky s nízkou životaschopnosťou prinášajú druhé skreslenie. Štandardizovaná metóda upozorňuje, že metylénová modrá môže pri životaschopnosti pod približne 80% nadhodnocovať skutočnú životaschopnosť, pretože bunky, ktoré ešte redukujú farbivo, si nemusia zachovať schopnosť rozmnožovania. Pivovarnícka literatúra opisuje rovnakú nespoľahlivosť pri výrazne zníženej životaschopnosti. Metylénovú modrú berte ako rýchly orientačný odhad a zásadné rozhodnutia pri nízkej životaschopnosti, napríklad opätovné zakvasenie kultúrou, potvrďte počítaním kolónií na platniach alebo doplnkovým farbením.

Tretím faktorom sú vplyvy matrice. Metóda OIV prebieha pri pH približne 4.6 a upozorňuje, že vzorky s nízkym pH a silnou pufračnou kapacitou bránia správnemu správaniu farbiva. Zároveň neodporúča test pri obsahu cukru nad 100 g/L, keď bunky pôsobia zavádzajúco svetlomodro. Experimentálne porovnanie pH pri farbení zistilo výrazne odlišnú citlivosť v testovanom rozsahu, čo je v súlade so štúdiou metódy s metylénovou modrou závislej od pH. Samostatnou nástrahou sú nečistoty: zafarbené častice v znečistených rmutových vzorkách napodobňujú mŕtve bunky a zvyšujú variabilitu medzi hodnotiteľmi.

Táto variabilita je kvantifikovaná, nejde len o neformálne pozorovania. V šesťmesačnej pivovarníckej skúške opísanej v porovnaní kvasiniek FEMS dosiahli duplicitné merania s metylénovou modrou priemernú smerodajnú odchýlku 6.1% oproti 0.2% pri prietokovej cytometrii s oxonolom, pričom výsledky dvoch hodnotiteľov sa pri rovnakej vzorke líšili až o 13 percentuálnych bodov. Kvantitatívne porovnanie metód životaschopnosti z roku 2023 zistilo podstatne vyššiu presnosť fluorescenčnej mikroskopie a prietokovej cytometrie, pričom ukázalo, že výkonnosť závisí od druhu a matrice. Klasický opis metódy od Paintinga a Kirsopa (PMID 24430080) zostáva referenčným bodom a širší prehľad testov životaschopnosti a vitality kvasiniek (PMID 25154541) zaraďuje metylénovú modrú medzi doplnkové, nie definitívne testy. Trypánová modrá tu nie je automaticky lepšou voľbou: indikuje stratu integrity membrány, kým metylénová modrá indikuje príjem farbiva spolu s redukčnou aktivitou, takže stresované bunky môžu byť pri týchto dvoch farbivách klasifikované odlišne.

Respiračný experiment: merajte čas do vymiznutia modrej farby

Druhý test vôbec nevyužíva mikroskop. Kvasinky, glukóza a zriedená metylénová modrá sa vložia do uzavretej skúmavky a meria sa čas, za ktorý modrá farba zmizne. Pri metabolizme buniek vznikajú redukčné ekvivalenty, ktoré premieňajú modré farbivo na bezfarebnú formu, zatiaľ čo rozpustený kyslík ho oxiduje späť. Keď bunky znížia obsah kyslíka, prevládne redukcia a skúmavka sa odfarbí. Koncový bod teda odráža rovnováhu medzi respiráciou, koncentráciou farbiva a dostupnosťou kyslíka. Výsledok sa má uvádzať ako čas redukcie alebo odfarbenia metylénovej modrej, nie ako priama rýchlosť spotreby molekulárneho kyslíka.

Použite oveľa zriedenejšie farbivo než pri hodnotení životaschopnosti, aby nameraný čas spadal do praktického rozsahu. Príručka povinných praktických cvičení AQA pre úroveň A level tento postup dobre štandardizuje: 1 g glukózy na 100 mL vody zohriatej približne na 30 C, 5 g sušených kvasiniek pridaných bezprostredne pred použitím a pracovný roztok farbiva s koncentráciou približne 0.001%, pripravený zriedením 0.1 mL 1% zásobného roztoku na 100 mL. Zmiešajte 2 mL suspenzie kvasiniek s glukózou s 2 mL pracovného roztoku farbiva, nechajte zmes dosiahnuť skúšobnú teplotu, raz ju pretrepávajte 10 sekúnd, spustite časovač a už ju nepretrepávajte. Pretrepávanie opätovne privádza kyslík a vracia skúmavke modrú farbu, čo je najväčší jednotlivý artefakt postupu. AQA uvádza, že zmes by sa za bežných okolností mala pri 35 C odfarbiť približne do 5 minút, pričom priemery zo skúšok boli 275 s pri 20 C, 128 s pri 35 C a 145 s pri 45 C. Ide o príklady z jednej experimentálnej zostavy, nie o univerzálne referenčné hodnoty. Kvantitatívnu súvislosť medzi rýchlosťou redukcie a metabolicky aktívnymi kvasinkami v kontrolovaných podmienkach podporujú cielené štúdie redukcie vrátane práce evidovanej ako PMID 25773544 a mechanistickej štúdie v časopise Yeast (2014).

Ukážka časového priebehu (pôvodný materiál)

Nasledujúca tabuľka je pôvodná ukážka vytvorená pre tento článok s použitím vyššie opísanej zostavy podľa AQA: 2 mL zmesi kvasiniek s glukózou plus 2 mL pracovného roztoku farbiva s koncentráciou približne 0.001%, jedno 10-sekundové pretrepanie a potom nerušená inkubácia. Záznamy sú príkladmi údajov vo formáte, ktorý by mala používať skupina študentov, pričom index rýchlosti je definovaný ako 1 delené časom odfarbenia v sekundách. Vykonajte pokus s rovnakými skúmavkami a nahraďte tieto údaje nameranými hodnotami.

Zostrojte graf indexu rýchlosti v závislosti od teploty pre skúmavky A, B a C. Krivka stúpa a potom sa splošťuje alebo klesá, čo je očakávaný priebeh pri enzýmovo riadenom procese, nie priamka. Skúmavky D, E a F nie sú dátovými bodmi tejto krivky. Sú to kontroly, ktoré umožňujú krivku interpretovať.

Kontroly, ktoré dávajú každému testu význam

Každá séria respiračných testov potrebuje tri sprievodné kontroly. Prevarené alebo usmrtené kvasinky s glukózou a farbivom by mali zostať modré, čo dokazuje, že rýchla redukcia závisí od metabolizmu živých buniek. Živé kvasinky s farbivom bez pridanej glukózy predstavujú substrátovú kontrolu, ale aj tak očakávajte pomalé odfarbenie, pretože kvasinky spotrebúvajú endogénne zásoby. Glukóza s farbivom bez kvasiniek je chemická slepá vzorka, ktorá je nevyhnutná, pretože glukóza v alkalickom prostredí môže redukovať metylénovú modrú aj bez prítomnosti buniek.

Počítanie životaschopných buniek potrebuje iný typ kontroly: stálosť postupu. Rovnaký zásobný roztok farbiva, rovnaký pomer miešania, rovnaký interval farbenia, rovnaká oblasť komôrky, rovnaké pravidlá pre púčiky a hranice a podľa možnosti zaslepené počítanie. Keď sa výsledky dvoch hodnotiteľov líšia o desať bodov, pracovný list zvyčajne odhalí príčinu: odlišný čas, odlišný prah modrého zafarbenia alebo odlišné pravidlá pre púčiky. Techniky prípravy a pozorovania zafarbených buniek súvisia s metódami jednoduchého farbenia baktérií, zatiaľ čo širší prehľad toho, čo farbivo označuje v rôznych vzorkách, nájdete v atlase mikroskopického farbenia. Fyzikálne pozadie kvantitatívneho vyhodnocovania akejkoľvek intenzity modrej farby vysvetľuje absorpčná referencia s označenými podmienkami: objasňuje, prečo sa pri každom koeficiente musia uvádzať aj podmienky týkajúce sa rozpúšťadla, pH a koncentrácie.

Test si vyberte podľa otázky. Koľko buniek je práve teraz živých, je otázka počítania, na ktorú odpoviete pri mikroskope s pracovným listom. Ako aktívne táto kultúra respiruje, je kinetická otázka, na ktorú odpoviete pomocou stopiek a skúmaviek za kontrolovaných podmienok. Metylénová modrá slúži na oboje, ale nikdy nie v tej istej skúmavke v rovnakom čase.