Metylénová modrá a ALS: prečo sa výsledky v experimentálnych modeloch líšia

Pri vyhľadávaní metylénovej modrej v súvislosti s ALS narazíte na dve tvrdenia, ktoré si zdanlivo odporujú. Jedno hovorí, že modré farbivo chránilo neuróny v modeloch ALS. Druhé hovorí, že u myší s ALS nemalo žiadny účinok. Obe tvrdenia odkazujú na skutočné vedecké práce a obe práce si zaslúžia vážnu pozornosť. Rozpor sa rozplynie, keď pomenujete princíp, ktorý stojí za každým experimentom: model určuje rozsah tvrdenia.

Výsledok u červa je tvrdením o červovi. Výsledok u rybej larvy je tvrdením o rybej larve. Ani jeden nie je tvrdením o pacientovi, kým ho nepodporí sledovanie priebehu ochorenia u cicavca. Tento článok porovnáva dve najčastejšie citované práce vedľa seba, aby ste videli, prečo sa ich závery líšia.

Dva experimenty v jednej tabuľke

Majte túto tabuľku pri čítaní poruke. Obsahuje všetky dôležité rozdiely medzi štúdiami.

Líši sa genetika, druhy, spôsob podania, načasovanie aj sledované ukazovatele. Genotyp je len jedným z piatich rozdielov, takže táto dvojica štúdií nemôže preukázať, že metylénová modrá pôsobí selektívne na jednu dráhu ALS. Preukazuje niečo užšie, no stále užitočné: výrazné obnovenie funkcie pri včasnej priamej expozícii v jednoduchých modeloch sa neprenieslo do priebehu ochorenia u cicavcov pri chronickom perorálnom podávaní.

Pozitívny výsledok: čo ukázala štúdia na červoch a rybách

V štúdii na červoch a rybách z roku 2012 sa mutantný ľudský TDP-43 alebo FUS exprimoval v motorických neurónoch červov a do rybích embryí sa injekčne vpravila mutantná ľudská mRNA. Ide o modely proteotoxicity. Reprodukujú toxické účinky mutantného proteínu na pohyb a tvar neurónov v priebehu dní, nie celý priebeh ALS u dospelého človeka počas rokov.

Liečba sa začala veľmi skoro. Červy od vyliahnutia rástli na agare obsahujúcom metylénovú modrú. Rybie embryá boli cez noc v roztoku liečiva, a to od 24 hodín po oplodnení; ich správanie sa testovalo približne o dva dni neskôr. Medzi liečivom a neurónom nestála hematoencefalická bariéra tak, ako je to u cicavca, a koncentrácia liečiva v plazme ani v mozgu sa nemerala.

Za týchto podmienok boli účinky výrazné a konzistentné. Koncentrácie 6 aj 60 μM znížili paralýzu závislú od veku u červov s TDP-43 a FUS. Na 12. deň dospelosti bolo paralyzovaných približne 80 percent neliečených červov s TDP-43 oproti približne 10 percentám červov liečených od vyliahnutia. Synaptický test naznačoval to isté: červy s TDP-43 boli precitlivené na aldikarb, látku používanú na skúmanie nervovosvalového prenosu, a metylénová modrá posunula odpoveď späť smerom k normálu. Počet degenerujúcich výbežkov motorických neurónov klesol, pričom najzreteľnejší účinok sa pozoroval pri 60 μM. U rýb sa výrazne zlepšilo plávanie vyvolané dotykom a skrátené motorické axóny pri 30 alebo 60 μM dorástli smerom k normálnej dĺžke, hoci obnovenie bolo len čiastočné, nie úplné.

Údaje o oxidačnom strese sú v súlade s antioxidačným vysvetlením. Mutantné červy a ryby vykazovali zvýšené ukazovatele reaktívnych foriem kyslíka, ktoré pri liečbe klesli, a normálne červy vystavené metylénovej modrej prežívali prooxidačnú záťaž oveľa dlhšie než neliečené červy. Dôležité sú však dve obmedzenia. Celkové hladiny mutantných proteínov TDP-43 a FUS neklesli a štúdia priamo nekvantifikovala proteínové agregáty, takže ukazuje obnovenie funkcie bez toho, aby preukázala odstránenie agregátov. Každý, kto sleduje bežné formulovanie redoxných a mitochondriálnych hypotéz, by mal tento mechanizmus považovať za podporený dôkazmi, nie však za definitívne potvrdený.

Najpoučnejším detailom bolo načasovanie. Keď autori počkali so začiatkom liečby do 5. dňa dospelosti, miera paralýzy na 12. deň bola približne 55 percent namiesto približne 10 percent pri liečbe od vyliahnutia. Rovnaké liečivo, rovnaký červ, rovnaká mutácia, oveľa menší účinok. Veľká časť zdanlivého prínosu vyplývala zo skorej profylaktickej expozície.

Nulový výsledok: čo ukázala štúdia na myšiach so SOD1

Štúdia na myšiach z roku 2011 položila náročnejšiu otázku v prísnejšom systéme. U kongénnych myší so SOD1 G93A ochorenie postupuje od trasu zadných končatín cez poruchu chôdze a stratu vzpriamovacieho reflexu až po vopred definovaný terminálny koncový bod. Liečba sa začala pred nástupom príznakov na 45. deň a pokračovala denne, pričom pozorovatelia hodnotili neurologický stav na škále od 0 do 6. Ide o experiment sledujúci celý priebeh ochorenia, a preto je bližší tomu, čo by zaujímalo pacienta, než akákoľvek krivka paralýzy u červov.

Hlavné výsledky boli nulové. Celkový nástup príznakov nastal po 121 dňoch v kontrolnej skupine oproti 124 dňom pri metylénovej modrej; rozdiel nebol významný. Prežívanie do konečného štádia bolo 167 dní oproti 170 dňom, čo tiež nebolo významné. Niekoľko čiastkových sekundárnych analýz vyznelo v prospech liečby: u samíc sa nástup príznakov oneskoril približne o 7 dní a liečené zvieratá strávili o niečo viac času v miernejších štádiách a menej v závažných. Vzhľadom na malé podskupiny podľa pohlavia a množstvo porovnaní štádií tieto čiastkové výsledky skôr podnecujú hypotézy, než poskytujú dôkaz. Nemerali sa počty neurónov, nevykonal sa test agregácie SOD1 ani sa nesledovali oxidačné či zápalové markery, takže štúdia nedokáže povedať ani to, či liečivo dosiahlo svoje ciele a zlyhalo, alebo na ne pri tejto dávke vôbec nezačalo pôsobiť. Testovala sa len jedna dávka.

Samotní autori upozornili na najzásadnejšie obmedzenie, ktoré platí oboma smermi. Model SOD1 G93A s vysokým počtom kópií dobre modeluje ochorenie spôsobené toxickým SOD1, ale toto ochorenie tvorí len malú časť familiárnej ALS a jeho biológia sa líši od väčšiny sporadických prípadov. Navrhli opätovne testovať kandidátne látky v cicavčích modeloch založených na TDP-43. Tento návrh sa odvtedy skomplikoval, pretože autori štúdie na červoch a rybách uvádzajú, že ani samostatná štúdia metylénovej modrej na myšiach s TDP-43 nezlepšila motorické výsledky. Látka teda môže v jednom systéme TDP-43 vykazovať výrazný účinok a v inom systéme TDP-43 žiadny. Systém je rovnako dôležitý ako gén.

Prečo zlepšenie u červa alebo ryby nemôže preukázať prínos pre pacientov

Predstavte si, že každý model odpovedá na inú otázku.

Po prvé, líši sa biológia. TDP-43 a FUS sú proteíny viažuce nukleové kyseliny, ktoré majú v týchto jednoduchých systémoch spoločné genetické interakcie, zatiaľ čo toxicita SOD1 pôsobí prostredníctvom čiastočne odlišných bezprostredných mechanizmov. Liečivo, ktoré zmierňuje jeden druh proteotoxického stresu, nemusí zmierňovať druhý a úspech pri nadmernej expresii v embryu nemusí predpovedať úspech pri pomalej neurodegenerácii v dospelosti sprevádzanej zápalom, zapojením gliových buniek a celkovým zhoršovaním stavu organizmu.

Po druhé, líši sa expozícia. Nepretržitá expozícia v roztoku s mikromolárnymi koncentráciami nie je perorálne podávanie. Medzi prehltnutou dávkou a motorickým neurónom miechy stoja vstrebávanie v čreve, metabolizmus pri prvom prechode pečeňou, väzba na plazmatické bielkoviny, prienik do mozgu a klírens. Ani jedna štúdia nemerala koncentrácie liečiva v nervovom systéme, takže ani jedna nedokáže prepojiť svoju koncentráciu s koncentráciou v druhej štúdii.

Po tretie, líši sa načasovanie. Prínosy u červov a rýb vo veľkej miere záviseli od liečby ešte pred nahromadením patologických zmien. Aj liečba myší sa začala pred príznakmi, čo je silnou stránkou, no u ľudí by sa takmer vždy začínala až po nástupe príznakov, teda ešte neskôr. Profylaktický signál v dvojdňovom teste na embryách je východiskom pre výskum, nie modelom klinického použitia.

Po štvrté, líšia sa sledované ukazovatele. Paralýza na 12. deň, citlivosť na aldikarb, dĺžka axónov v mikrometroch a vzdialenosť preplávaná rybou sú bezprostredné fenotypové prejavy. Nástup príznakov a prežívanie u cicavca zahŕňajú všetky kompenzačné aj komplikujúce procesy v tele. Liečivá bežne menia bezprostredné merané ukazovatele bez toho, aby menili prežívanie, a práve preto sa u cicavcov používajú ukazovatele času do udalosti.

Čitatelia, ktorí chcú kontrolný zoznam pre ďalší titulok, si ho môžu prevziať z článku ako čítať predklinické štúdie: pýtajte sa na druh, transgén, dávku a spôsob podania, či sa merali koncentrácie liečiva, kedy sa začala liečba vzhľadom na patologické zmeny, či bol sledovaným ukazovateľom krátkodobý fenotyp alebo priebeh ochorenia a či sa účinok zopakoval v druhom laboratóriu. Širší súbor dôkazov o metylénovej modrej u ľudí zostáva miestom, kde treba overiť, či sa niektorý z týchto skorých signálov rozvinul do klinických údajov.

Čo to znamená pre pacientov a rodiny

Z týchto prác nevyplýva žiadny zavedený protokol používania metylénovej modrej pri ALS. Pozitívna štúdia podporuje ďalší výskum oxidačných a synaptických mechanizmov v biológii TDP-43 a FUS. Nulová štúdia hovorí proti očakávaniu ovplyvnenia priebehu ochorenia pri chronickom perorálnom podávaní s touto expozíciou pri ochorení typu SOD1. Spoločne opisujú nekonzistentnosť medzi modelmi, nie odporúčanie liečby.

Bezpečnosť si zaslúži rovnako triezvy pohľad ako účinnosť. Štúdie ALS na myšiach nič nehovoria o bezpečnom dávkovaní u ľudí a metylénová modrá prináša skutočné riziká v podobe hemolýzy pri deficite G6PD a sérotonínovej toxicity pri kombinácii so sérotonergnými liekmi. Podozrenie na deficit G6PD, súčasné užívanie antidepresív a akákoľvek plánovaná zmena liekov patria do rozhovoru s lekárom, rovnako ako preštudovanie všeobecných údajov o bezpečnosti metylénovej modrej predtým, než niekto začne konať na základe titulkov o laboratórnych výsledkoch.

Záver sa zmestí do jednej vety. Metylénová modrá pri skorej expozícii výrazne obnovila fenotypové prejavy u červov a rybích lariev s TDP-43 a FUS, no v štúdii na myšiach so SOD1 pri chronickom perorálnom podávaní v zásade nepriniesla prínos v čase nástupu príznakov ani v prežívaní, takže poctivou interpretáciou sú dôkazy závislé od modelu, ktoré nepodporujú použitie u pacientov.