Kto vyvinul fialové farbenie krvi? Metylénová modrá, Malachowski, Romanowsky a Giemsa

Eozín je červený. Metylénová modrá je modrá. Zmiešajte ich, naneste zmes na zaschnutý krvný náter a niektoré jeho časti sa sfarbia na fialovo.

Nie všetky. V dobre pripravenom preparáte sa jadrá bielych krviniek sfarbia na červenofialovo a chromatín v malarickom parazitovi nadobudne rovnakú farbu, zatiaľ čo okolité červené krvinky zostanú ružové a cytoplazma sivomodrá. Práve fialová umožňuje rozlíšiť jednotlivé typy buniek.

Ani jedna fľaša neobsahuje fialovú farbu. Tá vzniká až vtedy, keď sa na podložnom sklíčku stretne určitý produkt rozkladu metylénovej modrej s eozínom. V 80. a 90. rokoch 19. storočia nikto nevedel, že tento produkt existuje, nieto ešte čo to je. Ľudia, ktorí sa snažili dosiahnuť túto farbu, pracovali sami s nečistými farbivami a nemali spoľahlivý spôsob, ako zistiť, čo je vo fľaši po dvoch mesiacoch státia na polici.

Preto má otázka v nadpise viac než jednu obhájiteľnú odpoveď a preto sa odpoveď v roku 2011 zmenila.

Výsledok, ktorý sa menil so zmesou

Toto farbenie nevzniklo jedným vynálezom. Vyvíjalo sa postupne. Každá zmena zmesi priniesla presne jednu novú viditeľnú informáciu a ich postupnosť je najzrozumiteľnejším spôsobom, ako túto históriu čítať.

Dôležitá je postupnosť v poslednom stĺpci. Každý pokrok rozšíril škálu farieb a každé rozšírenie zviditeľnilo ďalšiu štruktúru. Fialová nie je ozdobou tejto techniky; predstavuje rozdiel medzi tým, či vidíme prítomnosť parazita, a tým, či vidíme, z čoho sa skladá. Ako sa samotné farbivo dostalo z farbiarne BASF do medicíny, opisuje rozsiahlejšia história s vlastnými dokumentmi. Celá uvedená postupnosť so zdrojom ku každej položke je zachovaná ako časová os prispievateľov s odkazmi na zdroje.

Obrázok: tých istých šesť zmesí znázornených podľa toho, čo bolo v miske a čo z nej vzniklo. Kruhy predstavujú farbivá; bloky pod nimi predstavujú farby, ktoré tieto farbivá dokázali vytvoriť v krvnom nátere. Pred rokom 1890 sa červenofialový blok nevyskytuje a po ňom nechýba nikde.

Muž, ktorý použil bórax zámerne

Ernst Malachowski bol lekárom v Breslau, dnešnom Vroclave. Svoju kariéru strávil v súkromnej praxi a na malej klinike, ktorú viedol s kolegom, pričom laboratórnej práci sa venoval vo voľnom čase. Narodil sa v Strzelne 12. marca 1857, študoval medicínu na univerzite v Breslau a v rokoch 1882 až 1887 pracoval ako asistent na internom oddelení Nemocnice všetkých svätých, vtedy druhej najväčšej nemocnice v Nemecku.

V roku 1888 začal s dvojitým farbením podľa Chęcińského a Plehna. V preparáte pripravenom v roku 1889 videl, že chromatín jadra plazmódia sa farbí inak než cytoplazma, no následne zistil, že výsledok nedokáže zopakovať. Skúsil metylénovú modrú okysliť, čím sa výsledok zhoršil. Skúsil ju alkalizovať bóraxom, čo fungovalo zakaždým. Metódu verejne predviedol 15. júna 1890 a v auguste 1891 uverejnil podrobnejší opis vrátane pokynu na použitie bóraxu. Uviedol, že farbenie trvá dvadsaťštyri hodín a výsledky sa dajú ľahko reprodukovať.

Dvadsaťštyri hodín je v diagnostickom laboratóriu dlhý čas a jeho článok sa fialovočervenej farbe jadra parazita podrobne nevenoval. Nech bol dôvod akýkoľvek, zámernú alkalizáciu metylénovej modrej nikto neprevzal, kým ju v roku 1898 opäť nepoužil Nocht. Malachowski už o farbení krvi nikdy nepísal.

Dôvod, prečo sa o ňom donedávna vedelo tak málo, spočíva skôr v archívoch než v nejakej záhade. V medicínskej literatúre sa zachovalo sotva niečo z jeho života a to, čo prežilo, sa k nám dostalo jedinou cestou. Jeho dcéra Marie odišla v roku 1939 z Nemecka do Londýna, slúžila v britskej armáde a usadila sa v Kanade. Jej zbierka rodinných písomností sa napokon dostala do Inštitútu Lea Baecka v New Yorku. Jej brat Leo zahynul v prvej svetovej vojne. Jej sestru Evu deportovali v apríli 1942 z Breslau do tranzitného tábora Izbica a už sa nevrátila. Jej matka Hedwig si 22. apríla 1942 vzala život, aby nemusela čakať na rovnakú deportáciu. Malachowski zomrel v roku 1934, ešte pred všetkými týmito udalosťami.

Rodinná história s takýmto koncom je históriou, ktorá sa prestáva citovať. Dva články, ktoré Malachowského opäť zaradili do dejín vývoja tohto farbenia, oba uverejnené v roku 2011, vznikli z archívnych dokumentov v Poznani a Vroclave a z Mariiných písomností v New Yorku.

Plesnivá fľaša a Rus, ktorý mal šťastie

Dmitri Romanowsky študoval medicínu na Vojenskej lekárskej akadémii v Petrohrade a väčšinu svojej kariéry sa venoval malárii. V roku 1890 uverejnil metódu, ktorá bola na papieri takmer totožná s Chęcińského metódou: neupravená metylénová modrá a eozín, len s o niečo väčším množstvom eozínu.

V septembri 1891 uverejnil metódu, ktorá ho preslávila, a rozhodujúci detail bol ukrytý v pokynoch. Najlepšie výsledky dosahoval s die vorräthige Methylenlösung, zásobným roztokom metylénovej modrej, ktorý stál vyše dvoch mesiacov a rástla na ňom pleseň. Pleseň a čas státia spôsobili čiastočnú demetyláciu farbiva. Romanowsky to nevedel a nedokázal tento proces kontrolovať. Ostatní pracovníci, ktorí skúšali jeho metódu, preto nedokázali dosiahnuť fialovú. Svoju dizertačnú prácu odovzdal v Petrohrade v júni 1891, a preto sa v zaužívanom podaní považuje za rok objavu rok 1891.

Malachowski svoju metódu predviedol v júni 1890, o viac než rok skôr, a fungovala zámerne.

Prečo sa farbenie pomenovalo po nesprávnom človeku

Argumentáciu v prospech Malachowského zostavili Kristine Krafts, Ernst Hempelmann a Barbara Oleksyn a opiera sa o štyri veci. Dátum verejného predvedenia: jún 1890 oproti septembru 1891. Slovo zámerné oproti slovu náhodné. Skutočnosť, že Malachowski uverejnil svoju metódu vrátane bóraxu, zatiaľ čo Romanowského metóda závisela od nekontrolovanej premennej. A zistenie, že opis jadra plazmódia spolu s fialovou farbou, ktorá ho zviditeľnila, na sedem rokov prakticky zmizol z literatúry, pretože nikto nedokázal zopakovať náhodnú verziu.

Svoj záver formulujú priamo. V biografickom článku označujú pripísanie zásluh za „výsmech“ a citujú Ralpha Lillieho, ktorý v roku 1978 napísal, že „túto skupinu farbení by sme azda mali označovať ako Malachowského farbenia“.

Toto tvrdenie je sporné, ako to pri nárokoch na prvenstvo býva, a stojí za to vysvetliť povahu sporu, nie ho rozhodnúť. Argumentácia o prvenstve musí povedať, čo bolo predmetom objavu. Ak je objavom fialová farba, Malachowski má skoršie zdokumentované predvedenie. Ak je objavom uverejnená metóda, obaja muži publikovali v roku 1891 a farbenie sa pomenovalo po Romanowskom. Ak je objavom vysvetlenie, nárok nemá ani jeden, pretože ani jeden nevedel, že dozrievanie je demetylácia, a ani jeden nedokázal povedať, prečo sa farba vôbec objavuje. Práve tento posledný bod populárne podania vynechávajú. Účinnou zložkou bola nečistota, ktorú nikto neidentifikoval, a prvý človek, ktorý túto farbu vytvoril zámerne, to urobil na základe reprodukovateľného empirického postupu, nie vďaka pochopeniu jeho podstaty.

Dva články z roku 2011 sú najúplnejším publikovaným vyjadrením argumentácie v prospech Malachowského a oba sú voľne dostupné cez PubMed: rozsiahly prehľad na PMID 21235291 a biografický článok na PMID 21660627. Záznam prehľadu v PubMed uvádza aj komentár k nemu, uverejnený v tom istom časopise neskôr v danom roku na 86(5):366. Je to primeraná pripomienka, že argumentácia bola v tlači spochybnená hneď po zverejnení.

Tento spor nie je nezhodou o chémii. Všetci zúčastnení sa zhodujú v tom, čo je fialová farba a ktoré zložky ju vytvárajú. Nezhoda sa týka toho, kto sa k nej dostal ako prvý a či sa náhoda, ktorú nikto nedokázal zopakovať, vôbec počíta ako dosiahnutie výsledku.

Čo priniesli neskoršie mená

Ak fialovú vytvoril ako prvý Malachowski, prečo farbenie nesie mená Romanowsky, Wright a Giemsa?

Pretože farbenie, ktoré raz funguje v rukách svojho vynálezcu, ešte nie je použiteľným činidlom. Neskoršia práca premenila nevyspytateľnú zmes na niečo, čo mohol laborant v inej krajine použiť v bežný utorok.

Nocht sa k výsledku dopracoval úvahou. Keď sa mu nepodarilo získať spoľahlivý výsledok s jednoduchým neutrálnym farbivom, usúdil, že fialová musí pochádzať z niečoho v metylénovej modrej, čo nie je metylénovou modrou, a začal to hľadať. Unna si už predtým všimol, že zostarnuté roztoky metylénovej modrej farbia granuly žírnych buniek na červeno, a navrhol, že pri dozrievaní farbiva vzniká nová látka. Bernthsen v roku 1885 ukázal, že alkalické podmienky odstraňujú z metylénovej modrej metylové skupiny a že tieto produkty sú tým, čo dnes nazývame azúry. Nocht extrahoval aktívnu frakciu chloroformom a dokázal ju pomenovať iba ako Rot aus Methylenblau, červená z metylénovej modrej; Michaelis ju v roku 1901 nazval azúr I. Jenner vyriešil logistiku. Opätovné rozpustenie zrazeniny metylénovej modrej a eozínu v absolútnom metanole vytvorilo jediný stabilný roztok, ktorý náter počas farbenia zároveň fixoval a odstránil potrebu tepelnej fixácie. Leishman a Reuter spojili polychrómne farbivo s alkoholovým rozpúšťadlom a dosiahli súčasne stabilitu aj fialovú farbu. Wright nahradil dvanásťhodinovú inkubáciu pri 65 °C a desať dní státia jednou hodinou v prúde pary. Giemsa sa úplne prestal spoliehať na náhodne dozretý roztok. Použil odmerané množstvá známych farbív s glycerolom v metanole, aby prípravok vydržal tropické horúčavy. Nikdy nezverejnil, ako vyrábal čistý metylénový azúr. Predával ho laboratóriu Dr. Grüblera v Lipsku, ktoré ho uvádzalo na trh ako azúr I a tvrdilo, že iba jeho verzia je autentickým Giemsovým farbivom.

O identite tohto azúru sa stále vedú spory. Niektorí tvrdia, že išlo jednoducho o polychrómnu metylénovú modrú, iní, že obsahoval vysoký podiel Azure B. Odpoveď priniesla vojna. Keď sa nemecké farbivá stali nedostupnými, tím Verejnej zdravotnej služby Spojených štátov, Ralph Lillie s Mauriceom Roeom a Aimee Wilcox, zistil, že najlepšie farbenie poskytujú tri oddelené zložky: neupravená metylénová modrá, jej demetylovaný produkt rozkladu Azure B a eozín. Azure B nahradil nedostupný azúr I a tieto tri zložky sú dodnes základom farbenia používaného na diagnostiku malárie.

Chémia vzájomného pôsobenia týchto troch zložiek na podložnom sklíčku je samostatnou otázkou a témou inej stránky. Článok o úlohách farbív a chémii farbení Romanowského typu vysvetľuje, čo robia Azure B a eozín a prečo spolu vytvárajú farbu, ktorú ani jedna zložka nevytvára samostatne. Stránka o mikroskopii a laboratórnych aplikáciách sa venuje praktickej stránke: čo daný preparát ukazuje a ako posúdiť, či je konkrétny prípravok vhodný pre metódu, ktorú chcete použiť.

Časť histórie, ktorá je stále aktuálna

Jeden detail tohto príbehu neprestal platiť v roku 1902. Približne päťdesiat rokov bola najdôležitejšou zložkou svetového štandardného farbiva na maláriu nepomenovaná nečistota. Bola v ňom náhodou, jej množstvo sa medzi fľašami líšilo, jej identita bola istý čas obchodným tajomstvom a o jej podiele sa diskutovalo až do 40. rokov 20. storočia. Ľudia, ktorí farbivo používali, neboli nedbanliví. Nemali ako vedieť, čo je vo fľaši.

Modernou verziou toho istého problému je špecifikácia, ktorá opisuje iba časť materiálu. Súlad s USP je cestou k najvyššej čistote, akú trh ponúka, pretože ide o úplnú publikovanú normu, nie o jediné meranie: identita, čistota, organické nečistoty vrátane azúrových farbív, zvyškové rozpúšťadlá, elementárne nečistoty, zvyšok po žíhaní, mikrobiálne limity a bakteriálne endotoxíny. Blupreme získava metylénovú modrú od farmaceutického výrobcu a zverejňuje úplný certifikát analýzy, aby bolo možné každý bod tohto zoznamu overiť, nielen o ňom tvrdiť, že je splnený. Certifikát, ktorý uvádza výsledok skúšky na ťažké kovy a nazýva ho súladom s USP, je dnešným ekvivalentom fľaše označenej „dozretá metylénová modrá“: možno ide o kvalitné činidlo, no etiketa vám nehovorí, čo je v ňom.