Interpretácia vzhľadu kolónií E. coli a ďalších baktérií na agare EMB

Študent naočkuje neznámu vzorku rozterom na eozín-metylénový modrý agar, inkubuje ju cez noc a nájde na miske tmavé kolónie so zeleným leskom. Do zápisníka uvedie „E. coli, potvrdené“. Takýto zápis tvrdí viac, než možno z misky vyvodiť. Miska ukazuje fenotyp rastu a fermentácie za konkrétnych podmienok. Určenie druhu je samostatný záver, ktorý potrebuje samostatné dôkazy.

Táto príručka pristupuje k výsledkom na agare EMB ako k úlohe vyžadujúcej interpretáciu. Vysvetľuje základný princíp, predstavuje ilustračný atlas misiek s kontrolami a pomenúva prípady, v ktorých učebnicový obraz zavádza.

Princíp média

Agar EMB je selektívny aj diferenciačný. Farbivá eozín Y a metylénová modrá potláčajú mnohé grampozitívne mikroorganizmy, takže médium uprednostňuje rast gramnegatívnych mikroorganizmov. Tie isté farbivá slúžia ako indikátory: keď mikroorganizmus fermentuje dostupný cukor a vytvorí dostatok kyseliny v okolí, kolónia intenzívne prijíma farbivo a sfarbí sa na tmavofialovo až modročierno. Pri intenzívnej tvorbe kyseliny môže povrch kolónie vykazovať kovovo zelené dúhové odlesky. Protokol ASM pre misky s eozín-metylénovým modrým agarom opisuje túto kombináciu selekcie a diferenciácie a poskytuje referenčné fotografie na výučbu.

Pred interpretáciou akéhokoľvek výsledku je dôležitý jeden detail: overte, aké zloženie média sa používa. Staršia formulácia Holt Harris Teague obsahuje laktózu aj sacharózu, zatiaľ čo Levine EMB obsahuje iba laktózu. Mikroorganizmus, ktorý fermentuje sacharózu, ale nie laktózu, napríklad mnohé izoláty Serratia marcescens, môže na týchto dvoch verziách vyzerať odlišne. Dokumentácia výrobcu k médiám EMB tento rozdiel v zložení výslovne uvádza. Do zápisníka zaznamenajte spolu s výsledkom aj výrobcu a formuláciu.

Pripravený nenaočkovaný agar EMB má zvyčajne červenohnedú až červenofialovú farbu, niekedy so zelenkastým nádychom alebo jemnou zrazeninou. Táto základná farba nie je prejavom rastu. Každý výsledok porovnávajte s nenaočkovanou miskou alebo so zdokumentovaným východiskovým vzhľadom a primárnu misku vyhodnoťte približne po 18 až 24 hodinách aeróbnej inkubácie pri 35 až 37 C, pokiaľ výučbový protokol neurčuje inak. Dlhšia inkubácia môže zmeniť prejavy fermentácie.

Ako pozorovať misku

Použite dva druhy osvetlenia. Najprv misku prezrite v odrazenom alebo šikmo dopadajúcom svetle a nakláňajte ju: kovový lesk má dúhový charakter a podľa uhla pohľadu sa môže objaviť alebo zmiznúť. Potom ju prezrite v prechádzajúcom svetle, aby ste posúdili farbu kolónií a tmavé stredy. Vychádzajte z dobre izolovaných kolónií, pretože hustý rast a susedné kolónie menia lokálne hromadenie kyseliny a môžu sfarbenie potlačiť alebo zvýrazniť. Súbor obrázkov ASM to priamo ukazuje: E. coli v zmiešanej kultúre môže stratiť očakávaný lesk, pretože okolité mikroorganizmy menia kyslosť prostredia.

Vždy, keď to cvičenie umožňuje, zaraďte kontroly. Bežná výučbová zostava zahŕňa E. coli ATCC 25922 ako kontrolu modročierneho sfarbenia a kovového lesku, nefermentujúci mikroorganizmus, napríklad Salmonella Typhimurium ATCC 14028 alebo Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, ako kontrolu bezfarebného fenotypu a grampozitívny mikroorganizmus, napríklad Enterococcus faecalis alebo Staphylococcus aureus, ako kontrolu inhibície, ako uvádzajú štandardné tabuľky kontroly kvality pre médiá EMB. Ak pozitívna kontrola nemá lesk, najprv hľadajte príčinu v inkubácii, hustom raste alebo zložení média, až potom v neznámom izoláte.

Ilustračný atlas misiek

Misky nižšie sú vytvorené ilustrácie, nie fotografie skutočných kultúr. Ukazujú charakteristický vzhľad, ktorý treba hľadať, nie presný odtieň konkrétneho kmeňa. Porovnajte ich s referenčnými fotografiami ASM a so skutočnými miskami z výučbového laboratória.

Miska 1: Escherichia coli na agare EMB, intenzívne fermentujúca laktózu

E. coli na agare EMB býva tmavofialová až modročierna, často s tmavým stredom a kovovo zeleným leskom v dôsledku intenzívnej tvorby kyseliny. Lesk je známy znak, ktorý študenti hľadajú, ale považujte ho za podporný dôkaz, nie za definujúci znak. Intenzita lesku sa mení podľa kmeňa, času inkubácie, hustoty kolónií a uhla pohľadu. Neprítomnosť lesku nevylučuje E. coli a tmavá kolónia bez lesku môže poukazovať na viaceré iné fermentujúce mikroorganizmy. Na akúkoľvek ďalšiu prácu vyberte dobre izolovanú kolóniu namiesto hodnotenia husto zarasteného sektora.

Miska 2: Klebsiella pneumoniae na agare EMB, mukózny fermentujúci mikroorganizmus

Klebsiella pneumoniae na agare EMB zvyčajne tvorí veľké, lesklé, mukózne kolónie v ružovofialových až hnedofialových odtieňoch, často s tmavými stredmi, ale spravidla bez výrazného kovového lesku. Podobná morfológia sa vyskytuje pri príbuzných fermentujúcich mikroorganizmoch, napríklad Enterobacter. Mukózny charakter a veľkosť kolónie sú súčasťou hodnotenia: malá a plochá ružová kolónia má inú výpovednú hodnotu než veľká, vyklenutá mukózna kolónia. Rovnako ako pri E. coli, miska naznačuje fenotyp fermentácie a určenie na úrovni druhu vyžaduje biochemické potvrdenie opísané nižšie.

Miska 3: Salmonella na agare EMB a ďalšie nefermentujúce mikroorganizmy, bezfarebné kolónie

Salmonella na agare EMB a príbuzné mikroorganizmy nefermentujúce laktózu vrátane Shigella a mnohých izolátov Pseudomonas zvyčajne rastú ako bezfarebné až priesvitné alebo svetlojantárové kolónie. Pri niektorých formuláciách a podmienkach sa objavuje slabý ružovkastý nádych, takže svetloružová kolónia automaticky neznamená fermentujúci mikroorganizmus. EMB nerozlišuje Salmonella od Shigella ani od iných nefermentujúcich mikroorganizmov; toto rozlíšenie patrí následným testom. Zaznamenané boli aj laktóza-pozitívne kmene Salmonella s kovovo lesklými kolóniami podobnými E. coli, čo je ďalší dôvod, prečo jediná miska nemôže viesť ku konečnému záveru.

Miska 4: Serratia marcescens a úskalie zloženia média

Serratia marcescens si zaslúži samostatnú časť, pretože študenti často očakávajú červené kolónie a následne misku nesprávne vyhodnotia. Väčšina klinických izolátov nefermentuje laktózu, takže na Levine EMB sa bežne javia ako bledé až slabo sfarbené. Keďže mnohé izoláty fermentujú sacharózu, formulácia obsahujúca sacharózu môže vyvolať tmavšie sfarbenie alebo výraznejšiu reakciu spojenú s tvorbou kyseliny. Pri 35 až 37 C neočakávajte ani klasický červený pigment prodigiozín; tvorba pigmentu pri teplote inkubátora nie je spoľahlivá. Keď protokol uvádza Serratia marcescens na agare EMB, overte, akú formuláciu dané tvrdenie predpokladá. Prehľad metabolizmu Serratia sumarizuje laktóza-negatívny a pri sacharóze variabilný profil, ktorý stojí za týmto úskalím.

Miska 5: kontroly a inhibované mikroorganizmy

Grampozitívne mikroorganizmy, napríklad Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus a Bacillus, sú na agare EMB spravidla inhibované alebo výrazne potlačené, hoci inhibícia nie je pri každom kmeni úplná. Zostava kontrol umožňuje korektné hodnotenie: kontrola E. coli by mala vykazovať dobrý rast s modročiernym sfarbením a leskom, kontrola nefermentujúceho mikroorganizmu by mala vykazovať bezfarebný rast a kontrola inhibície by mala vykazovať slabý alebo žiadny rast. Ak kontrola inhibície rastie dobre, selektívny účinok zlyhal a všetky ostatné výsledky na tejto šarži sú sporné. Metódy farbenia odpovedajú na inú otázku než kultivačné médiá; k farbeniu mikroskopických preparátov v laboratóriu pozrite atlas farbenia metylénovou modrou.

Porovnanie s vymedzením limitov

Zavádzajúci vzhľad možno zhrnúť do troch viet. Tmavé sfarbenie neznamená E. coli, pretože Klebsiella, Enterobacter a ďalšie fermentujúce mikroorganizmy vytvárajú tmavé stredy bez lesku. Ružové sfarbenie neznamená Klebsiella, pretože stredne intenzívne alebo pomaly fermentujúce mikroorganizmy a niektoré mikroorganizmy označované ako nefermentujúce sa javia ako ružové alebo svetlofialové. Lesk neznamená definitívne potvrdenie E. coli, pretože ho môžu vytvárať aj iné intenzívne fermentujúce mikroorganizmy. Výučbový protokol a jeho obrázky zmiešaných kultúr ilustrujú každý z týchto prípadov nesprávnej interpretácie.

Limity potvrdenia

Agar EMB vypovedá o fenotype, nie o druhu. Rôzne mikroorganizmy môžu mať rovnaký vzhľad kolónií a jeden mikroorganizmus sa môže od svojho učebnicového obrazu odchýliť v závislosti od kmeňa, veku, hustoty rastu, zloženia média a inkubácie. Preto sa vo výučbových aj klinických pracovných postupoch morfológia na EMB považuje za podklad na predbežnú identifikáciu.

Obhájiteľný študentský postup je nasledovný: opíšte izolovanú kolóniu (veľkosť, farbu, stred, lesk v šikmo dopadajúcom svetle, mukózny charakter), zaznamenajte formuláciu, čas a teplotu inkubácie a kontroly; potom pred akýmkoľvek potvrdzujúcim testom preočkujte dobre izolovanú kolóniu na získanie čistej kultúry. Medzi bežné následné vyšetrenia patrí Gramovo farbenie spolu s reakciami IMViC na predbežnú identifikáciu E. coli a koliformných baktérií, TSI alebo KIA a biochemické panely špecifické pre daný mikroorganizmus pri črevných mikroorganizmoch, doplnené o sérologickú identifikáciu, MALDI TOF alebo inú validovanú identifikáciu, ak si to úloha vyžaduje. Súvislosti o tom, ako EMB zapadá medzi selektívne a diferenciačné médiá pre črevné mikroorganizmy, nájdete v úvodoch ku kultivačným médiám pre črevné mikroorganizmy a v článku o následnom Gramovom farbení. Pri súvisiacej otázke, čo môže a nemôže preukázať modré farbenie mikroskopického preparátu, atlas farbenia metylénovou modrou v rovnakom duchu oddeľuje pozorovanie od záveru.

Najprv zapíšte pozorovanie, až potom záver. „Tmavé modročierne kolónie so zeleným leskom závislým od uhla pohľadu na Levine EMB po 24 hodinách, v súlade s intenzívnou fermentáciou laktózy“ je obhájiteľné tvrdenie. „E. coli, potvrdené“ vyžaduje potvrdzujúci krok, ktorý samotná miska nemôže poskytnúť.