Interpretarea aspectului coloniilor de E. coli și al altor colonii pe agar EMB

Un student însămânțează prin striere o probă necunoscută pe agar cu eozină și albastru de metilen, o incubează peste noapte și găsește apoi pe placă colonii întunecate cu un luciu verde. În caiet notează „E. coli, confirmat”. Această însemnare afirmă mai mult decât poate susține placa. Placa arată un fenotip de creștere și fermentare în condiții specifice. Identitatea speciei este o afirmație separată, care necesită dovezi separate.

Acest ghid abordează rezultatele pe agar EMB ca pe o sarcină de interpretare. Explică principiul de bază, prezintă un atlas ilustrativ al plăcilor, cu controale, și identifică situațiile în care imaginea din manual induce în eroare.

Principiul din spatele plăcii

Agarul EMB este atât selectiv, cât și diferențial. Coloranții eozină Y și albastru de metilen inhibă multe microorganisme Gram pozitive, astfel încât mediul favorizează creșterea celor Gram negative. Aceiași coloranți acționează ca indicatori: când un microorganism fermentează zahărul disponibil și produce suficient acid local, colonia fixează intens colorantul și capătă o culoare de la violet închis la albastru-negru. În cazul unei producții intense de acid, suprafața coloniei poate prezenta o irizație verde metalică. Protocolul ASM pentru plăci cu agar cu eozină și albastru de metilen descrie această combinație de selecție și diferențiere și oferă fotografii de referință pentru predare.

Un detaliu contează înainte de interpretarea oricărui rezultat: verifică ce formulă este utilizată. Formula mai veche Holt Harris Teague conține lactoză și zaharoză, în timp ce EMB Levine conține doar lactoză. Un microorganism care fermentează zaharoza, dar nu și lactoza, precum multe izolate de Serratia marcescens, poate avea un aspect diferit pe cele două versiuni. Documentația producătorului pentru mediile EMB precizează explicit această diferență de formulă. Notează în caiet producătorul și formula, alături de rezultat.

Agarul EMB preparat, dar neînsămânțat, are de obicei o culoare de la roșu-brun la violet-roșiatic, uneori cu o tentă verzuie sau un precipitat fin. Această culoare de fond nu reprezintă creștere microbiană. Compară fiecare interpretare cu o placă neînsămânțată sau cu aspectul inițial documentat și citește placa primară după aproximativ 18 până la 24 de ore de incubare aerobă la 35 până la 37 C, dacă protocolul didactic nu specifică altceva. Incubarea prelungită poate modifica aspectul asociat fermentării.

Cum să examinezi placa

Folosește două tipuri de iluminare. Mai întâi inspectează placa în lumină reflectată sau oblică și înclin-o: luciul metalic este irizat și poate apărea sau dispărea în funcție de unghiul de observare. Apoi examineaz-o în lumină transmisă pentru a evalua culoarea coloniilor și centrele întunecate. Examinează colonii bine izolate, deoarece aglomerarea și coloniile învecinate modifică acumularea locală de acid și pot atenua sau accentua culoarea. Setul de imagini ASM demonstrează direct acest lucru: E. coli dintr-o cultură mixtă își poate pierde luciul așteptat deoarece microorganismele din jur modifică mediul acid.

Include controale ori de câte ori exercițiul permite. Un set didactic obișnuit include E. coli ATCC 25922 pentru fenotipul albastru-negru cu luciu metalic, un nefermentator precum Salmonella Typhimurium ATCC 14028 sau Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 pentru fenotipul incolor și un microorganism Gram pozitiv precum Enterococcus faecalis sau Staphylococcus aureus drept control al inhibiției, așa cum sunt enumerate în tabelele standard de control al calității pentru mediile EMB. Dacă lipsește luciul la controlul pozitiv, suspectează mai întâi incubarea, aglomerarea sau formula mediului, înainte de a suspecta proba necunoscută.

Atlas ilustrativ al plăcilor

Plăcile de mai jos sunt ilustrații generate, nu fotografii ale unor culturi reale. Ele arată tiparul de urmărit, nu nuanța exactă a unei anumite tulpini. Compară-le cu fotografiile de referință ASM și cu plăci reale din laboratorul didactic.

Placa 1: Escherichia coli pe agar EMB, fermentator intens al lactozei

E. coli pe agar EMB are de obicei o culoare de la violet închis la albastru-negru, adesea cu un centru întunecat și un luciu verde metalic datorat producției intense de acid. Luciul este aspectul bine-cunoscut pe care îl caută studenții, dar trebuie tratat ca o dovadă de susținere, nu ca o definiție. Intensitatea luciului variază în funcție de tulpină, timpul de incubare, densitatea coloniilor și unghiul de observare. Absența luciului nu exclude E. coli, iar o colonie întunecată fără luciu poate indica mai mulți alți fermentatori. Alege o colonie bine izolată pentru orice analiză ulterioară, în loc să interpretezi un sector aglomerat.

Placa 2: Klebsiella pneumoniae pe agar EMB, fermentator cu aspect mucoid

Klebsiella pneumoniae formează de obicei pe agar EMB colonii mari, strălucitoare, mucoide, în nuanțe de la roz-violet la brun-violet, adesea cu centre întunecate, dar de regulă fără un luciu metalic puternic. O morfologie similară apare la fermentatori înrudiți, precum Enterobacter. Textura mucoidă și dimensiunea coloniei fac parte din interpretare: o colonie roz, mică și plată are o altă semnificație decât una mare, bombată și mucoidă. Ca și în cazul E. coli, placa sugerează un fenotip de fermentare, iar identificarea la nivel de specie necesită confirmarea biochimică descrisă mai jos.

Placa 3: Salmonella pe agar EMB și alți nefermentatori, colonii incolore

Salmonella pe agar EMB și microorganismele înrudite care nu fermentează lactoza, inclusiv Shigella și multe izolate de Pseudomonas, cresc de obicei sub formă de colonii incolore, translucide sau de culoarea chihlimbarului pal. Unele formule și condiții produc o ușoară tentă roz, astfel încât o colonie roz pal nu indică automat un fermentator. EMB nu diferențiază Salmonella de Shigella sau de alți nefermentatori; această diferențiere se face prin teste ulterioare. De asemenea, au fost documentate tulpini de Salmonella care fermentează lactoza și formează colonii metalice asemănătoare celor de E. coli, încă un motiv pentru care o singură placă nu poate încheia identificarea.

Placa 4: Serratia marcescens și capcana formulei mediului

Serratia marcescens merită o secțiune proprie deoarece studenții se așteaptă adesea la colonii roșii și apoi interpretează greșit placa. Majoritatea izolatelor clinice nu fermentează lactoza, astfel încât pe EMB Levine apar frecvent palide sau slab colorate. Deoarece multe izolate fermentează zaharoza, o formulă care conține zaharoză poate produce o reacție mai întunecată sau mai pronunțată, asociată cu producția de acid. Nu te aștepta nici la pigmentul roșu clasic, prodigiozina, la 35 până la 37 C; producția de pigment nu este constantă la temperatura de incubare. Când protocolul menționează Serratia marcescens pe agar EMB, verifică ce formulă presupune acea afirmație. O sinteză despre metabolismul Serratia rezumă tiparul de nefermentare a lactozei și fermentare variabilă a zaharozei care stă la baza acestei capcane.

Placa 5: controale și microorganisme inhibate

Microorganismele Gram pozitive precum Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus și Bacillus sunt în general inhibate sau au creșterea puternic redusă pe agar EMB, deși inhibiția nu este absolută pentru fiecare tulpină. Un set de controale asigură o interpretare corectă: controlul E. coli ar trebui să prezinte o creștere bună, cu o culoare albastru-neagră și luciu, controlul nefermentator ar trebui să prezinte o creștere incoloră, iar controlul inhibiției ar trebui să prezinte o creștere redusă sau absentă. Dacă controlul inhibiției crește bine, etapa de selecție a eșuat și toate celelalte interpretări pentru acel lot sunt îndoielnice. Metodele de colorare răspund la o altă întrebare decât mediile de cultură; pentru partea de laborator dedicată colorării pe lamă, consultă atlasul colorării cu albastru de metilen.

Comparație cu limite clare

Trei propoziții rezumă aspectele înșelătoare. O culoare întunecată nu înseamnă E. coli, deoarece Klebsiella, Enterobacter și alți fermentatori dezvoltă centre întunecate fără luciu. Roz nu înseamnă Klebsiella, deoarece fermentatorii moderați sau lenți și unele microorganisme clasificate drept nefermentatoare apar roz sau de culoarea lavandei. Luciul nu înseamnă identificare certă a E. coli, deoarece și alți fermentatori intenși îl pot produce. Protocolul didactic și imaginile sale cu culturi mixte ilustrează fiecare dintre aceste erori.

Limitele confirmării

Agarul EMB indică un fenotip, nu o specie. Microorganisme diferite pot avea același aspect al coloniilor, iar un microorganism se poate abate de la imaginea din manual în funcție de tulpină, vârstă, aglomerare, formula mediului și incubare. De aceea, procedurile didactice și clinice tratează morfologia pe EMB ca pe un indiciu prezumtiv.

O procedură justificabilă pentru studenți este următoarea: descrie colonia izolată (dimensiune, culoare, centru, luciu în lumină oblică, caracter mucoid), notează formula mediului, timpul și temperatura de incubare, precum și controalele; apoi obține o cultură pură prin subcultivarea unei colonii bine izolate, înainte de orice test de confirmare. Investigațiile ulterioare obișnuite includ colorația Gram și reacțiile IMViC pentru identificarea prezumtivă a E. coli și a coliformilor, TSI sau KIA și seturi de teste biochimice specifice microorganismului pentru microorganismele enterice, cu identificare serologică, MALDI TOF sau prin alte metode validate, acolo unde sarcina o cere. Pentru context privind locul EMB printre mediile enterice selective și diferențiale, consultă materialele introductive despre mediile de cultură enterice și investigațiile ulterioare prin colorația Gram. Pentru întrebarea conexă despre ce poate și ce nu poate demonstra o colorare albastră pe lamă, atlasul colorării cu albastru de metilen păstrează, în același spirit, distincția dintre observație și concluzie.

Scrie observația înaintea concluziei. „Colonii albastru-negre închise, cu luciu verde dependent de unghiul de observare, pe EMB Levine la 24 de ore, compatibile cu fermentarea intensă a lactozei” este o formulare justificabilă. „E. coli, confirmat” necesită etapa de confirmare pe care placa singură nu o poate furniza.