Cine a dezvoltat colorația violetă a sângelui? Albastrul de metilen, Malachowski, Romanowsky și Giemsa

Eozina este roșie. Albastrul de metilen este albastru. Amestecați-le, aplicați amestecul pe un frotiu de sânge uscat, iar unele părți ale frotiului devin violete.

Nu toate. Într-un preparat reușit, nucleii globulelor albe capătă o nuanță roșu-violet, iar în interiorul unui parazit al malariei cromatina capătă aceeași culoare, în timp ce globulele roșii din jur rămân roz, iar citoplasma rămâne gri-albăstruie. Violetul este cel care permite diferențierea tipurilor de celule.

Niciunul dintre flacoane nu conține violet. Culoarea apare numai atunci când un anumit produs de degradare al albastrului de metilen întâlnește eozina pe lamă, iar în anii 1880 și 1890 nimeni nu știa că acel produs există, cu atât mai puțin ce era. Cei care încercau să obțină culoarea lucrau singuri, cu coloranți impuri, fără o metodă sigură de a afla ce se găsea într-un flacon după ce acesta stătuse două luni pe un raft.

De aceea, întrebarea din titlu are mai multe răspunsuri justificabile și tot de aceea răspunsul s-a schimbat în 2011.

Un rezultat vizual care se schimba odată cu amestecul

Colorația nu a fost inventată dintr-odată. S-a construit treptat. Fiecare modificare a amestecului a adus exact un nou element de informație vizibilă, iar succesiunea acestor elemente este cea mai clară modalitate de a înțelege istoria.

Evoluția din ultima coloană este cea importantă. Fiecare progres a lărgit gama de culori, iar fiecare extindere a făcut vizibilă încă o structură. Violetul nu este un simplu ornament al tehnicii; el face diferența dintre a vedea că un parazit este prezent și a vedea din ce este alcătuit. Felul în care colorantul însuși a trecut dintr-o fabrică de coloranți BASF în medicină este o istorie mai amplă, cu propriile documente. Întreaga succesiune de mai sus, cu sursa fiecărei contribuții, este păstrată într-o cronologie a contribuitorilor cu linkuri către surse.

Figură: aceleași șase amestecuri, reprezentate prin ceea ce se afla în vas și ceea ce rezulta din el. Cercurile reprezintă coloranții; dreptunghiurile de dedesubt reprezintă culorile pe care aceștia le puteau produce într-un frotiu de sânge. Niciun amestec de dinainte de 1890 nu are un dreptunghi roșu-violet, iar niciunul de după nu este lipsit de el.

Omul care a folosit boraxul intenționat

Ernst Malachowski era medic în Breslau, astăzi Wrocław, și și-a petrecut cariera în practica privată și într-o mică clinică pe care o conducea împreună cu un coleg, desfășurând activități de laborator în timpul liber. S-a născut la Strzelno pe 12 martie 1857, a studiat medicina la Universitatea din Breslau și a lucrat din 1882 până în 1887 ca asistent în medicină internă la Spitalul Tuturor Sfinților, pe atunci al doilea ca mărime din Germania.

A început în 1888 cu dubla colorație Chęciński și Plehn. Într-un preparat realizat în 1889, a observat că cromatina nucleului plasmodial se colora diferit de citoplasmă, dar apoi a constatat că nu putea reproduce rezultatul. A încercat să acidifice albastrul de metilen, ceea ce a înrăutățit lucrurile. A încercat să îl alcalinizeze cu borax, ceea ce a funcționat de fiecare dată. A prezentat metoda public pe 15 iunie 1890 și a publicat o descriere mai detaliată în august 1891, inclusiv instrucțiunea de folosire a boraxului. A menționat că procesul de colorare dura douăzeci și patru de ore și că rezultatele erau ușor de reprodus.

Douăzeci și patru de ore înseamnă mult într-un laborator de diagnostic, iar articolul său nu insista asupra culorii violet-roșii a nucleului parazitului. Oricare ar fi fost motivul, nimeni nu a reluat alcalinizarea deliberată a albastrului de metilen până când Nocht a făcut-o din nou în 1898. Malachowski nu a mai scris niciodată despre colorarea sângelui.

Motivul pentru care până de curând se știau atât de puține despre el ține de arhive, nu de vreun mister. Aproape nicio urmă a vieții sale nu a supraviețuit în literatura medicală, iar ceea ce s-a păstrat a ajuns la noi pe o singură cale. Fiica sa Marie a plecat din Germania la Londra în 1939, a servit în armata britanică și s-a stabilit în Canada, iar colecția sa de documente de familie a ajuns la Institutul Leo Baeck din New York. Fratele ei, Leo, a fost ucis în Primul Război Mondial. Sora ei, Eva, a fost deportată din Breslau în lagărul de tranzit Izbica în aprilie 1942 și nu s-a mai întors. Mama ei, Hedwig, și-a luat viața pe 22 aprilie 1942, în loc să aștepte aceeași deportare. Malachowski murise în 1934, înainte de toate acestea.

O istorie de familie care se încheie astfel este o istorie de familie care nu mai este citată. Cele două articole care l-au readus pe Malachowski în istoria dezvoltării colorației, ambele publicate în 2011, au fost alcătuite pe baza documentelor de arhivă din Poznań și Wrocław și a documentelor lui Marie din New York.

Un flacon cu mucegai și un rus norocos

Dmitri Romanowsky a studiat medicina la Academia Medicală Militară din Sankt Petersburg și a lucrat în domeniul malariei în cea mai mare parte a carierei sale. În 1890 a publicat o metodă care, pe hârtie, era aproape identică cu cea a lui Chęciński: albastru de metilen nemodificat și eozină, cu puțin mai multă eozină.

În septembrie 1891 a publicat metoda care l-a făcut cunoscut, iar detaliul esențial era ascuns în instrucțiuni. Cele mai bune rezultate le obținea cu soluția de metilen păstrată în stoc, o soluție de rezervă de albastru de metilen care stătuse peste două luni și pe care se dezvoltase mucegai. Mucegaiul și timpul de păstrare demetilaseră parțial colorantul. Romanowsky nu știa acest lucru și nu îl putea controla, iar alți cercetători care i-au încercat metoda nu au putut obține violetul. Teza sa fusese depusă la Sankt Petersburg în iunie 1891, motiv pentru care relatarea obișnuită consideră 1891 anul descoperirii.

Demonstrația lui Malachowski avusese loc în iunie 1890, cu mai bine de un an înainte, iar metoda sa funcționa datorită unei intervenții intenționate.

De ce numele a fost atribuit omului greșit

Argumentele în favoarea lui Malachowski au fost reunite de Kristine Krafts, Ernst Hempelmann și Barbara Oleksyn și se bazează pe patru elemente. Data demonstrației publice: iunie 1890, față de septembrie 1891. Cuvântul intenționat, față de cuvântul întâmplător. Faptul că Malachowski și-a publicat metoda, inclusiv folosirea boraxului, în timp ce metoda lui Romanowsky depindea de o variabilă necontrolată. Și observația că descrierea nucleului plasmodial, împreună cu violetul care îl făcea vizibil, a dispărut practic din literatură timp de șapte ani, deoarece nimeni nu putea reproduce varianta accidentală.

Concluzia lor este categorică. În articolul biografic, ei numesc atribuirea „o denaturare” și îl citează pe Ralph Lillie, care scria în 1978 că „poate ar trebui să ne referim la această familie de colorații ca la colorațiile Malachowski”.

Afirmația este contestată, așa cum se întâmplă de obicei cu revendicările de prioritate, iar natura disputei merită explicată, nu tranșată. Un argument despre prioritate trebuie să precizeze în ce a constat descoperirea. Dacă descoperirea este culoarea violetă, Malachowski are demonstrația documentată mai timpurie. Dacă descoperirea este metoda publicată, ambii au publicat în 1891, iar colorația a primit numele lui Romanowsky. Dacă descoperirea este explicația, niciunul nu poate revendica meritul, deoarece niciunul nu știa că maturarea însemna demetilare și niciunul nu putea spune de ce apărea culoarea. Tocmai acest ultim punct este omis în relatările de popularizare. Ingredientul activ era o impuritate pe care nimeni nu o identificase, iar primul om care a produs culoarea în mod deliberat a făcut-o pe baza unei rețete empirice reproductibile, nu pe baza înțelegerii mecanismului acesteia.

Cele două articole din 2011 reprezintă cea mai completă prezentare publicată a argumentelor în favoarea lui Malachowski și ambele pot fi citite gratuit pe PubMed: ampla analiză la PMID 21235291 și articolul biografic la PMID 21660627. Înregistrarea PubMed a analizei include și un comentariu asupra ei, publicat în aceeași revistă mai târziu în acel an, la 86(5):366, ceea ce amintește, pe bună dreptate, că argumentul a fost contestat în publicații imediat ce a apărut.

Disputa nu este însă un dezacord privind chimia. Toți cei implicați sunt de acord asupra naturii violetului și asupra componentelor care îl produc. Dezacordul privește cine a ajuns primul la rezultat și dacă un accident pe care nimeni nu îl putea reproduce poate fi considerat cu adevărat o realizare a acestui rezultat.

Ce au adus contribuțiile ulterioare

Dacă Malachowski a produs primul violetul, de ce colorația poartă numele lui Romanowsky, Wright și Giemsa?

Pentru că o colorație care funcționează o singură dată în mâinile inventatorului său nu este un reactiv. Munca ulterioară a transformat un amestec capricios în ceva ce un tehnician din altă țară putea folosi într-o zi de marți.

Nocht a ajuns la rezultat prin raționament. După ce nu a reușit să obțină un rezultat fiabil cu un simplu colorant neutru, a concluzionat că violetul trebuie să provină din ceva aflat în albastrul de metilen, dar care nu era albastru de metilen, și a început să caute acea substanță. Unna observase deja că soluțiile învechite de albastru de metilen colorau în roșu granulațiile mastocitelor și propusese că, pe măsură ce colorantul se matura, se forma o substanță nouă. Bernthsen demonstrase în 1885 că mediul alcalin îndepărtează grupările metil din albastrul de metilen și că acești produși sunt ceea ce numim acum azuri. Nocht a extras fracția activă cu cloroform și nu a putut să o numească decât roșu din albastru de metilen; Michaelis a numit-o azur I în 1901. Jenner a rezolvat logistica. Redizolvarea precipitatului de albastru de metilen și eozină în metanol absolut a produs o singură soluție stabilă, care fixa frotiul în timp ce îl colora și elimina necesitatea fixării termice. Leishman și Reuter au combinat colorantul policromat cu un solvent alcoolic și au obținut atât stabilitatea, cât și violetul. Wright a înlocuit incubarea de douăsprezece ore la 65 °C și repausul de zece zile cu o oră în curent de abur. Giemsa a renunțat complet la dependența de o soluție maturată aleatoriu, folosind cantități măsurate de coloranți cunoscuți, cu glicerol în metanol, astfel încât produsul să reziste căldurii tropicale. Nu a publicat niciodată modul în care obținea azur de metilen pur. L-a vândut laboratorului doctorului Grübler din Leipzig, care l-a comercializat ca azur I și a susținut că numai varianta sa era colorația Giemsa autentică.

Identitatea acelui azur este încă subiect de dispută. Unii susțin că era pur și simplu albastru de metilen policromat, alții că era bogat în Azure B. Răspunsul a apărut în urma unui război. Când coloranții germani nu mai puteau fi procurați, o echipă a Serviciului de Sănătate Publică al Statelor Unite, formată din Ralph Lillie, Maurice Roe și Aimee Wilcox, a constatat că cea mai bună colorare se obținea cu trei componente separate: albastru de metilen nemodificat, produsul său de degradare demetilat Azure B și eozină. Azure B a înlocuit azurul I, care nu mai era disponibil, iar aceste trei componente constituie și astăzi baza colorației folosite pentru diagnosticarea malariei.

Chimia interacțiunii acestor trei componente pe lamă este o întrebare separată, tratată pe altă pagină. Pagina despre rolurile coloranților și chimia colorațiilor de tip Romanowsky explică ce face fiecare dintre Azure B și eozină și de ce perechea produce o culoare pe care niciunul nu o produce singur. Pagina despre microscopie și aplicații de laborator tratează latura practică: ce arată un anumit preparat și cum se apreciază dacă un anumit produs este potrivit pentru metoda pe care intenționați să o utilizați.

Partea istoriei care este încă actuală

Un detaliu din această poveste nu a încetat să fie valabil în 1902. Timp de aproximativ cincizeci de ani, cea mai importantă componentă a colorației standard folosite în întreaga lume pentru malarie a fost o impuritate fără nume. Era prezentă din întâmplare, cantitatea ei varia de la un flacon la altul, identitatea ei a fost secret comercial o parte din acel timp, iar proporția ei a fost discutată până în anii 1940. Cei care foloseau colorația nu erau neglijenți. Nu aveau cum să știe ce se afla în flacon.

Versiunea modernă a aceleiași probleme este o specificație care descrie numai o parte din material. Conformitatea cu USP este calea către cea mai înaltă puritate disponibilă pe piață, deoarece presupune un standard publicat complet, nu o singură măsurătoare: identitate, puritate, impurități organice, inclusiv coloranții de tip azur, solvenți reziduali, impurități elementale, reziduu la calcinare, limite microbiene și endotoxine bacteriene. Blupreme își procură albastrul de metilen de la un producător farmaceutic și publică certificatul de analiză complet, astfel încât fiecare element din această listă să poată fi verificat, nu doar afirmat. Un certificat care raportează un rezultat pentru metale grele și îl numește conformitate cu USP este echivalentul actual al unui flacon etichetat „albastru de metilen maturat”: poate fi un reactiv foarte bun, dar eticheta nu vă spune ce se află în el.