Teste pe drojdii cu albastru de metilen: numărarea celulelor vii versus cronometrarea respirației

Două eprubete stau pe masa de laborator. Ambele sunt albastre. Într-una, celulele albastre observate la microscop înseamnă drojdii moarte. În cealaltă, o eprubetă care trece de la albastru la incolor înseamnă că drojdia este vie și respiră. Același colorant, interpretări opuse. Dacă confundați cele două teste, toate concluziile se inversează.

Această distincție este tema întregului articol. Albastrul de metilen este un colorant redox: în forma oxidată este albastru, iar în forma redusă este leuco-albastru de metilen, incolor. Numărarea pentru estimarea viabilității exploatează această chimie într-o observație microscopică de scurtă durată. Un experiment de respirație o exploatează într-o reacție cronometrată în întregul volum al probei. Fiecare necesită propriul protocol, propriii martori și propria evaluare critică.

Numărarea pentru estimarea viabilității: colorare scurtă, citire promptă

Protocolul utilizat în fabricile de bere este varianta cea mai standardizată. Preparați albastru de metilen 0.01% w/v în citrat de sodiu 2%, amestecați-l 1:1 cu suspensia de drojdie și examinați amestecul după un interval scurt, fix. Intervalele publicate variază de la 1 la 2 minute în manualul Brewing Science Institute până la aproximativ 5 minute în protocoalele de cercetare, iar metoda OIV de microbiologie a vinului impune examinarea în decurs de 10 minute. Concentrația colorantului în amestecul de numărare ajunge la aproximativ 0.005%. Încărcați o cameră Neubauer îmbunătățită și, la o mărire de aproximativ 400x, clasificați celulele albastru închis drept neviabile, iar celulele necolorate drept viabile. În metoda OIV, celulele albastru deschis sunt considerate vii, ceea ce sugerează deja problema subiectivității discutată mai jos.

Concentrația celulară se calculează din geometria camerei. Când se numără întregul pătrat central de 1 mm, numărul de celule per mL este egal cu N înmulțit cu factorul de diluție și cu 10^4, unde N este numărul de celule din acea suprafață, conform metodelor ASBC pentru drojdii. Viabilitatea se calculează mai simplu: numărul de celule necolorate împărțit la numărul total de celule, înmulțit cu 100. Numărați aproximativ 400 de celule pentru estimarea viabilității, conform studiului comparativ FEMS din industria berii și practicii OIV. Aplicați consecvent aceeași regulă pentru limitele grilei, de exemplu incluzând celulele de pe liniile de jos și din stânga și excluzându-le pe cele de pe liniile de sus și din dreapta.

Mugurii necesită o regulă stabilită înainte de începerea numărării. O convenție uzuală numără un mugure ca celulă separată când ajunge la aproximativ jumătate din dimensiunea celulei-mamă; sub această dimensiune, este numărat împreună cu celula-mamă. Indiferent de regula aleasă, aplicați-o în fiecare pătrat și notați-o pe fișă, astfel încât următoarea persoană să o poată reproduce.

Fișă de numărare (de tipărit)

Această fișă este un material original creat pentru acest articol. Copiați-o într-un caiet sau tipăriți câte una pentru fiecare probă.

Viabilitate (%) = 100 x necolorate / (necolorate + albastru închis). Numărul total de celule per mL = N x factorul de diluție x 10^4, unde N provine din suprafața definită a camerei. Notați intervalul de colorare lângă rezultat, deoarece o valoare a viabilității fără intervalul aferent nu este reproductibilă.

De ce variază valorile viabilității

Momentul citirii este prima interferență și poate afecta rezultatul în ambele sensuri. Celulele active metabolic reduc colorantul, astfel încât o citire prea timpurie poate surprinde celule vii înainte ca acestea să termine reducerea și le poate clasifica greșit drept moarte. Însă expunerea prelungită este ea însăși toxică și produce celule albastre cu deteriorare reală, generând rezultate fals pozitive la identificarea celulelor moarte prin colorare. De aceea, un protocol didactic de laborator specifică evaluarea în decurs de 5 minute, conform unui protocol didactic pentru drojdii din Wisconsin. Formularea prudentă este că evaluarea cu albastru de metilen depinde de timp: alegeți un interval scurt și mențineți-l constant pentru fiecare probă dintr-o serie.

Probele cu viabilitate scăzută prezintă o a doua sursă de eroare sistematică. Metoda standardizată avertizează că albastrul de metilen poate supraestima viabilitatea reală sub aproximativ 80%, deoarece celulele care încă reduc colorantul nu își păstrează neapărat capacitatea de reproducere. Literatura din industria berii descrie aceeași lipsă de fiabilitate când viabilitatea este mult redusă. Considerați albastrul de metilen un mijloc de estimare rapidă și aproximativă și confirmați deciziile critice privind probele cu viabilitate scăzută, precum reutilizarea unei culturi pentru inocularea unei noi șarje, prin numărare pe plăci sau cu un colorant complementar.

Efectele matricei sunt a treia sursă de interferență. Metoda OIV se desfășoară la un pH de aproximativ 4.6 și avertizează că probele cu pH scăzut și capacitate mare de tamponare împiedică funcționarea corectă a colorantului. Totodată, recomandă evitarea testului la concentrații de zahăr peste 100 g/L, când celulele apar în mod înșelător albastru deschis. O comparație experimentală a pH-ului de colorare a constatat modificări substanțiale ale sensibilității în intervalul testat, în concordanță cu un studiu privind dependența metodei cu albastru de metilen de pH. Resturile constituie o capcană separată: particulele colorate din plămezile încărcate cu impurități imită celulele moarte și sporesc variabilitatea între operatori.

Această variabilitate este cuantificată, nu doar anecdotică. Într-un studiu de șase luni într-o fabrică de bere, raportat în comparația FEMS a metodelor pentru drojdii, măsurătorile în duplicat cu albastru de metilen au avut o abatere standard medie de 6.1%, față de 0.2% pentru citometria în flux cu oxonol, iar rezultatele a doi operatori au diferit cu până la 13 puncte procentuale pentru aceeași probă. O comparație cantitativă din 2023 a metodelor de evaluare a viabilității a constatat că microscopia de fluorescență și citometria în flux sunt considerabil mai precise, arătând totodată că performanța depinde de specie și de matrice. Descrierea clasică a metodei de către Painting și Kirsop (PMID 24430080) rămâne punctul de referință, iar o analiză mai amplă a testelor de viabilitate și vitalitate a drojdiilor (PMID 25154541) plasează albastrul de metilen printre testele complementare, nu printre cele definitive. Albastrul de tripan nu reprezintă automat o îmbunătățire în acest context: el indică pierderea integrității membranei, în timp ce albastrul de metilen indică pătrunderea colorantului împreună cu activitatea reducătoare, astfel încât celulele stresate pot fi clasificate diferit cu cei doi coloranți.

Experimentul de respirație: cronometrați dispariția culorii albastre

Al doilea test nu implică examinarea la microscop. Drojdia, glucoza și albastrul de metilen diluat sunt introduse într-o eprubetă închisă, iar cronometrul măsoară timpul necesar dispariției culorii albastre. Pe măsură ce celulele metabolizează, generează echivalenți reducători care transformă colorantul albastru în forma sa incoloră, în timp ce oxigenul dizolvat îl reoxidează. Când celulele reduc suficient nivelul oxigenului, predomină reducerea netă, iar eprubeta se decolorează. Prin urmare, punctul final reflectă echilibrul dintre respirație, concentrația colorantului și disponibilitatea oxigenului și trebuie raportat ca timp de reducere sau de decolorare a albastrului de metilen, nu ca viteză directă de consum al oxigenului molecular.

Folosiți un colorant mult mai diluat decât la evaluarea viabilității, astfel încât timpul măsurat să se încadreze într-un interval convenabil. Manualul AQA al lucrărilor practice obligatorii pentru nivelul A standardizează bine acest aspect: 1 g de glucoză la 100 mL de apă încălzită la aproximativ 30 C, 5 g de drojdie uscată adăugată imediat înainte de utilizare și o soluție de lucru de colorant de aproximativ 0.001%, preparată prin diluarea a 0.1 mL dintr-o soluție stoc de 1% până la 100 mL. Amestecați 2 mL de suspensie de drojdie cu glucoză cu 2 mL de soluție de lucru de colorant, echilibrați la temperatura de testare, agitați o singură dată timp de 10 secunde, porniți cronometrul și nu mai agitați. Agitarea reintroduce oxigen și face eprubeta din nou albastră, constituind cel mai important artefact procedural. AQA menționează că preparatul ar trebui, în mod normal, să se decoloreze în aproximativ 5 minute la 35 C, cu medii experimentale de 275 s la 20 C, 128 s la 35 C și 145 s la 45 C. Acestea sunt exemple dintr-un singur montaj experimental, nu valori de referință universale. Legătura cantitativă dintre viteza de reducere și drojdiile active metabolic în condiții controlate este susținută de studii dedicate reducerii, inclusiv lucrarea indexată ca PMID 25773544 și studiul mecanistic din Yeast (2014).

Demonstrație a evoluției în timp (material original)

Tabelul de mai jos este o demonstrație originală realizată pentru acest articol folosind montajul de tip AQA descris mai sus: 2 mL de amestec de drojdie cu glucoză plus 2 mL de soluție de lucru de colorant de aproximativ 0.001%, o singură agitare de 10 secunde, apoi incubare fără perturbare. Înregistrările sunt valori exemplificative, în formatul pe care ar trebui să îl folosească un grup de elevi, indicele de viteză fiind definit ca 1 împărțit la timpul de decolorare în secunde. Efectuați experimentul cu aceleași eprubete și înlocuiți aceste înregistrări cu valori măsurate.

Reprezentați grafic indicele de viteză în funcție de temperatură pentru eprubetele A, B și C. Curba crește, apoi se aplatizează sau scade, acesta fiind tiparul așteptat pentru un proces enzimatic, nu o linie dreaptă. Eprubetele D, E și F nu sunt puncte de date pe acea curbă. Ele sunt martorii care permit interpretarea curbei.

Martorii care dau sens fiecărui test

Fiecare serie de teste de respirație necesită trei probe însoțitoare. Drojdia fiartă sau omorâtă, împreună cu glucoza și colorantul, ar trebui să rămână albastră, demonstrând că reducerea rapidă depinde de metabolismul celulelor vii. Drojdia vie cu colorant, fără glucoză adăugată, este un martor pentru substrat, dar așteptați-vă totuși la o decolorare lentă, deoarece drojdia consumă rezervele endogene. Glucoza cu colorant, fără drojdie, este proba martor chimică, esențială deoarece glucoza în mediu alcalin poate reduce albastrul de metilen fără prezența celulelor.

Numărarea pentru estimarea viabilității necesită un alt tip de control: constanța procedurii. Aceeași soluție stoc de colorant, același raport de amestecare, același interval de colorare, aceeași suprafață a camerei, aceleași reguli pentru muguri și pentru limitele grilei, cu numărare în orb acolo unde este posibil. Când rezultatele a doi operatori diferă cu zece puncte procentuale, fișa dezvăluie de obicei cauza: intervale diferite, praguri diferite pentru intensitatea albastrului sau reguli diferite pentru muguri. Tehnicile de pregătire și observare a celulelor colorate se leagă de metodele de colorare simplă a bacteriilor, iar o prezentare mai amplă a structurilor marcate de colorant în diferite specimene se găsește în atlasul de colorare pentru microscopie. Pentru principiile fizice ale măsurării cantitative a oricărei intensități de albastru, referința de absorbție cu condiții specificate explică de ce fiecare coeficient trebuie însoțit de condițiile sale privind solventul, pH-ul și concentrația.

Alegeți testul în funcție de întrebare. Câte celule sunt vii în acest moment este o întrebare de numărare, la care se răspunde la microscop, cu o fișă. Cât de activ respiră această cultură este o întrebare de cinetică, la care se răspunde cu un cronometru și eprubete în condiții controlate. Albastrul de metilen servește ambelor scopuri, dar niciodată în aceeași eprubetă, în același timp.