Albastrul de metilen pentru colorarea ADN-ului și ARN-ului: aplicații în geluri și pe membrane

Un student rulează un gel de agaroză, îl colorează cu albastru de metilen și nu vede nimic acolo unde se aștepta la o bandă intensă. La bancul alăturat, un cercetător postdoctoral colorează o membrană Northern folosind același flacon albastru și obține benzi ribozomale bine definite în trei minute. Studentul concluzionează că gelul a eșuat. Gelul nu a eșuat. Cele două aplicații erau diferite, iar același colorant răspunde la ele cu sensibilități diferite, fonduri diferite și reguli diferite pentru etapele următoare.

Colorarea ADN-ului și colorarea ARN-ului cu albastru de metilen au la bază aceeași chimie, dar nu același scop. Într-un gel, colorantul indică ce cantitate de acid nucleic se află într-o matrice poroasă. Pe o membrană, indică dacă transferul a reușit și dacă pistele au fost încărcate uniform. Odată înțeleasă această diferență, protocoalele, limitele de detecție și limitele de compatibilitate devin clare.

Răspunsul pe scurt

Albastrul de metilen este un colorant cationic planar care se leagă de acizii nucleici necovalent și reversibil, printr-o combinație de atracție electrostatică față de grupările fosfat, intercalare între perechile de baze și asociere cu șanțul minor. Tocmai această reversibilitate este importantă. Benzile pot fi colorate și vizualizate în lumină vizibilă, documentate, apoi decolorate sau purificate pentru clonare, hibridizare ori rehibridizare cu o sondă.

Pentru colorarea ADN-ului bicatenar în geluri de agaroză cu albastru de metilen, rețeta rapidă standard este de 0.02 procente m/v (200 micrograme per mL) în apă, cu aproximativ 15 minute de colorare și aproximativ 15 minute de decolorare în apă, urmate de vizualizare pe un transiluminator cu lumină albă. Pentru membrane, rețeta clasică de blot Northern folosește 0.02 până la 0.04 procente de colorant în acetat de sodiu la un pH de aproximativ 5.2, cu câteva minute de colorare după transfer și imobilizare, apoi o clătire cu apă și decolorare completă înainte de hibridizare. Sensibilitatea este modestă: zeci până la sute de nanograme per bandă de gel în condiții bune, iar ghidurile prudente indică 0.5 până la 1 microgram. Aceste cantități sunt cu ordine de mărime peste cele necesare pentru bromura de etidiu și coloranții SYBR. Pe membrane, nu există o limită de detecție utilă pentru un transcript individual, deoarece colorarea evidențiază în principal ARN-ul ribozomal abundent și materialul total încărcat. Nu înlocui soluția din niciuna dintre rețete cu o soluție comercială destinată suplimentelor. Metodele validate presupun utilizarea unui colorant de puritate analitică, a unor tampoane cu compoziție definită și, când este implicat ARN-ul, manipularea în condiții lipsite de RNaze.

Cum funcționează legarea și unde poate induce în eroare

Modelul util are trei componente. În primul rând, sistemul de inele încărcat pozitiv este atras de scheletul fosfat încărcat negativ. Studiile spectroscopice arată că această contribuție electrostatică predomină la concentrații mici de săruri, în timp ce modelarea și dinamica moleculară indică intercalarea și legarea în șanțul minor drept moduri stabile pentru ADN-ul bicatenar, după cum rezumă un studiu spectroscopic al legării albastrului de metilen de ADN. În al doilea rând, există o anumită preferință pentru GC: modelarea favorizează segmentele CpG și GpC, iar experimentele raportează o asociere preferențială cu duplexurile bogate în GC în cercetările privind preferințele de intercalare ale albastrului de metilen, însă și duplexurile AT leagă colorantul. Colorarea de rutină nu este specifică secvenței. În al treilea rând, ADN-ul monocatenar și ARN-ul leagă colorantul în principal prin interacțiuni electrostatice și suprapunere cu bazele accesibile și regiunile duplex, motiv pentru care intensitatea colorării variază cu lungimea, secvența și structura secundară.

De aici rezultă două consecințe. Deoarece legarea este necovalentă, colorantul se îndepărtează prin spălare. Benzile din poliacrilamidă se estompează rapid dacă nu sunt fixate în mod deliberat, iar o variantă specială de fixare permanentă există tocmai pentru că colorarea obișnuită este temporară, așa cum descriu Soto și Draper pentru gelurile PAGE. Deoarece colorantul este un fotosensibilizator, iluminarea intensă și prelungită a ADN-ului colorat în prezența oxigenului poate oxida guanina și, în cele din urmă, poate produce rupturi monocatenare, mecanism detaliat în cercetările privind oxidarea guaninei fotosensibilizată de albastrul de metilen. Vizualizarea scurtă în lumină albă evită deteriorarea bine cunoscută produsă de UV în procedurile clasice cu bromură de etidiu, iar acest avantaj este real pentru recuperarea preparativă. Lumina vizibilă este mai blândă, nu inofensivă. Menține iluminarea scurtă dacă ADN-ul urmează să fie clonat. Pentru contextul fotochimic mai amplu al acestei precauții, consultă cele două căi din fotochimia albastrului de metilen. Pentru perechea redox și stările de sarcină care explică de ce forma oxidată se leagă, iar cea redusă nu, consultă chimia structurii și proprietăților albastrului de metilen.

Prima aplicație: colorarea în geluri

Colorarea gelurilor răspunde la o singură întrebare: există suficient acid nucleic în această bandă pentru a fi văzut cu ochiul liber? ADN-ul bicatenar în agaroză este cazul cel mai bine caracterizat. Metoda originală de colorare a gelurilor cu albastru de metilen, elaborată de Flores și colaboratorii, a validat protocolul rapid cu 0.02 procente pe agaroză de 1 procent și a demonstrat recuperarea și clonarea ulterioară cu succes. Același protocol al furnizorului apare pe pagina produsului albastru de metilen de la IBI Scientific, care prezintă alături rețeta de 0.04 procente pentru membrane și varianta rapidă pentru geluri.

Procedură practică:

1. Rulează gelul în mod obișnuit. Colorează după electroforeză, nu în timpul acesteia, cu excepția cazului în care transferul sau rezoluția au fost validate pentru o metodă modificată.
2. Scufundă gelul în albastru de metilen de 0.02 procente m/v în apă distilată, cu agitare ușoară, timp de aproximativ 15 minute.
3. Decolorează prin schimbări repetate ale apei, aproximativ 15 minute în total, până când fondul matricei scade și benzile se disting.
4. Fotografiază imediat pe un transiluminator cu lumină albă.

Agaroza și poliacrilamida se comportă diferit. Agaroza reține colorantul în matrice, astfel încât decolorarea este etapa lentă. Gelurile subțiri de poliacrilamidă se colorează rapid, dar pierd și colorantul rapid, ceea ce ajută excizia preparativă și îngreunează păstrarea unei documentații de arhivă. Oligonucleotidele sintetice din poliacrilamidă pot fi localizate cu aceeași rețetă de 0.02 procente în 20 până la 30 de minute, cu spălări repetate cu apă, urmând metode PAGE consacrate de tip Current Protocols. Au fost raportate variante foarte diluate, de aproximativ 0.0002 procente în TBE diluat, pentru oligonucleotide preparative, pe parcursul mai multor ore, însă baza de dovezi este mai slabă.

Diferența dintre ADN și ARN contează. ADN-ul bicatenar oferă cea mai puternică legare structurată. ARN-ul și ADN-ul monocatenar se colorează, dar mai slab și mai puțin previzibil. Pentru gelurile de agaroză cu formaldehidă destinate ARN-ului, majoritatea laboratoarelor renunță la colorarea cu albastru în gel și transferă mai întâi ARN-ul pe o membrană, apoi îl colorează acolo. Această schimbare înlocuiește un semnal slab în gel cu un semnal mai clar pe membrană și oferă totodată o evidență a încărcării.

A doua aplicație: colorarea pe membrane

Colorarea membranelor răspunde la o altă întrebare: a reușit transferul și sunt pistele comparabile? Aplicația clasică este colorarea reversibilă a bloturilor Northern, elaborată de Herrin și Schmidt, care folosea inițial 0.04 procente de colorant în acetat de sodiu de 50 mM la pH 5.0, timp de 2 până la 3 minute, cu o clătire cu apă; colorantul putea fi îndepărtat cu SDS diluat în SSPE înainte de hibridizare.

Varianta modernă utilizată pe scară largă se desfășoară astfel:

1. Transferă ARN-ul sau ADN-ul denaturat pe nailon ori nitroceluloză, apoi imobilizează-l prin reticulare cu UV sau tratament termic, pentru ca proba să nu se piardă în timpul colorării.
2. Opțional, dar frecvent: umezește membrana în acid acetic de 5 procente timp de aproximativ 15 minute.
3. Colorează timp de 5 până la 10 minute în albastru de metilen de 0.02 până la 0.04 procente, în acetat de sodiu de 0.3 până la 0.5 M, la un pH de aproximativ 5.2.
4. Clătește și decolorează în apă timp de 5 până la 15 minute, documentează rezultatul, apoi îndepărtează colorantul rezidual înainte de hibridizare.

Nailonul încărcat pozitiv predomină în lucrările Northern. Nitroceluloza funcționează și ea cu aceeași procedură bazată pe acid acetic și acetat. Imaginea este folosită pentru a confirma transferul, a compara benzile 28S și 18S (sau 23S și 16S pentru ARN-ul bacterian), a marca scările de markeri și standardele și a păstra o evidență aproximativă pentru normalizarea pe baza ARN-ului total. Metodele Northern publicate cuantifică benzile ribozomale colorate pentru verificarea încărcării, inclusiv cercetări din domeniul științei lactatelor care au folosit benzi ribozomale colorate cu albastru de metilen pentru normalizare. Membranele Southern pot fi vizualizate în același mod, însă colorantul este mult mai bine consacrat pentru verificarea încărcării și transferului în Northern, iar ADN-ul pentru Southern este denaturat înainte de transfer, astfel încât valorile sensibilității în gel nu se aplică.

Limite de detecție și fond: unde albastrul pierde teren

Comparația de mai jos este intenționat aproximativă. Performanța colorantului depinde de procentul gelului, lățimea benzii, sistemul optic și rigoarea decolorării. Consideră fiecare valoare un ordin de mărime, nu o specificație.

Controlul fondului decide dacă semnalul modest este utilizabil. Colorantul liber este intens colorat, astfel încât contrastul se obține prin îndepărtarea colorantului nelegat fără a-l elimina pe cel legat. Un colorant mai concentrat aduce rareori un plus de sensibilitate. În principal, prelungește timpul de decolorare. Testează o serie de diluții folosind exact gelul, membrana și camera respective și utilizează doar intervalul în care densitatea integrată rămâne proporțională cu cantitatea introdusă. Albastrul de metilen permite normalizarea semicantitativă a încărcării. Nu este o metodă cantitativă cu interval dinamic larg, deoarece capacitatea membranei, eficiența transferului, saturația și decolorarea variază de la o pistă la alta.

Limite de compatibilitate: ce rămâne posibil după colorare

Clonarea după colorarea cu albastru a fost demonstrată. Flores și colaboratorii au excizat benzi de agaroză colorate, au recuperat ADN-ul, apoi au efectuat ligarea și transformarea, raportând o clonare mai bună decât după utilizarea bromurii de etidiu cu UV. Motivul probabil este deteriorarea fotochimică mai redusă, nu un beneficiu al colorantului în sine. Menține expunerea la lumină albă scurtă și purifică ADN-ul recuperat printr-o procedură obișnuită de extracție din gel.

Pentru PCR și secvențiere, dovezile sunt mai puține. Colorantul rezidual se leagă de acizii nucleici, așa că decolorează și purifică înainte de etapele enzimatice. Se anticipează că ADN-ul purificat corespunzător dintr-un gel colorat cu albastru va funcționa, însă toleranța la colorantul rezidual pentru diferite polimeraze și sisteme de secvențiere nu este bine cuantificată. Nu o presupune.

Hibridizarea pe blot este compatibilă când ordinea este respectată strict: transfer, imobilizare, colorare, documentare, decolorare, hibridizare. Aceasta este succesiunea concepută de Herrin și Schmidt. Colorarea înainte de transfer sau omiterea decolorării reprezintă o metodă diferită și necesită propria validare. După îndepărtarea colorantului, îndepărtarea standard a sondelor și rehibridizarea cu o sondă nouă se desfășoară normal. Pentru colorarea la nivel celular cu aceeași familie de coloranți și pentru a înțelege de ce principiile aplicate preparatelor fixate nu se transferă metodelor pentru celule vii, consultă atlasul colorării pentru microscopie.

Excizia benzilor funcționează pentru agaroza preparativă și pentru oligonucleotidele PAGE localizate cu albastru, cu condiția să fie evitată varianta de fixare permanentă. Electroeluția după decolorare este plauzibilă chimic pentru un agent de legare reversibilă, însă datele controlate privind randamentul, specifice albastrului de metilen, sunt limitate. Desalinizează sau precipită după eluție.

Probleme care se repetă

Benzile slabe din gel înseamnă, de obicei, o masă prea mică pentru o colorare colorimetrică, mai ales în cazul țintelor monocatenare scurte sau al ARN-ului. Încarcă mai mult material, folosește colorant proaspăt, prelungește colorarea înainte de a crește concentrația și oprește decolorarea mai devreme. Un gel complet albastru, fără contrast, indică de obicei o colorare excesivă sau prea puține schimbări ale apei. Estomparea benzilor PAGE este un comportament chimic așteptat, nu o colorare eșuată. Fotografiază rapid. Fondul neuniform al membranei indică pliuri, bule, amprente, agitare neuniformă sau transfer neuniform. Nu interpreta acest lucru drept încărcare inegală fără un control de hibridizare. Un profil ribozomal slab și difuz poate indica degradare, dar și transfer incomplet, prea puțin ARN total (pistele obișnuite conțin de la câteva până la zeci de micrograme) sau decolorare excesivă. Colorantul evidențiază ARN-ul ribozomal abundent. Nu evidențiază un transcript specific. Aceasta este sarcina sondei.

Siguranță și manipulare fără exagerări

Albastrul de metilen este mai simplu de manipulat decât bromura de etidiu, dar nu este inofensiv. O fișă actuală cu date de securitate MilliporeSigma clasifică acest colorant în categoria 4 de toxicitate acută orală, nociv în caz de înghițire, și prevede eliminarea printr-o procedură aprobată de gestionare a deșeurilor, conform fișei cu date de securitate Sigma-Aldrich pentru albastrul de metilen. Bromura de etidiu are avertismente mai severe privind genotoxicitatea, inclusiv efecte suspectate asupra celulelor germinale în fișa sa cu date de securitate Sigma-Aldrich, iar gelurile și soluțiile sale sunt de obicei colectate separat ca deșeuri chimice periculoase, după cum precizează ghidul Thermo Fisher pentru coloranții acizilor nucleici. Respectă fișele cu date de securitate și regulile instituției pentru ambele substanțe. Păstrează colorantul uscat într-un recipient bine închis și ferit de umezeală, reutilizează soluția de colorare numai în măsura permisă de protocol, depozitează membranele colorate în stare uscată între foi de hârtie de filtru și fotografiază gelurile înainte ca benzile să se disperseze prin difuzie.

Reține regula de la bancul de laborator. Gelurile verifică vizibilitatea la încărcare mare, în lumină albă. Membranele verifică transferul și încărcarea înainte ca sonda să realizeze detecția sensibilă. Un singur colorant servește ambelor scopuri, cu sensibilitate modestă, legare reversibilă și o ordine strictă a operațiilor.