Albastrul de metilen în cercetarea pe pești-zebră: aditiv de întreținere și factor de confuzie experimental

Apa pentru icrele de pește-zebră este adesea ușor albastră, iar aproape nimeni nu consemnează motivul. Colorantul este albastru de metilen, adăugat împotriva fungilor, iar majoritatea protocoalelor îl tratează ca pe un element de fundal. Fundalul nu este conceptul potrivit aici. Mai potrivit este cel de factor experimental neconsemnat: ceva prezent în recipientele tratate și absent din controale, activ farmacologic la concentrațiile utilizate și capabil să modifice chiar parametrii pe care îi măsoară experimentul.

Această distincție structurează tot ce urmează. Utilizarea antifungică de rutină în întreținere este o chestiune. Dacă aditivul este neutru în raport cu testul folosit este o alta. Literatura recentă despre peștii-zebră răspunde liniștitor la prima și neliniștitor la a doua.

Ce prevăd de fapt ghidurile

Nu există un singur standard, iar acest lucru face parte din problemă. Ghidul Canadian Council on Animal Care permite 0.5 mg/L, sau 0.00005%, în soluția de transport pentru icre și larve, pentru a reduce dezvoltarea fungilor. Ghidurile europene privind animalele de laborator descriu embrioni menținuți într-un mediu care conține adesea aceeași concentrație de 0.00005%. Rețeta E3 de la Cold Spring Harbor specifică o concentrație dublă, 1 mg/L sau 0.0001%, ca ingredient al rețetei. În contrast, există o omisiune evidentă: ghidul OECD pentru testarea toxicității pe embrioni de pește specifică apă de diluție reconstituită și substanța chimică de testat, fără nicio recomandare privind albastrul de metilen, nici în versiunea din 2013, nici în revizuirea ulterioară. Astfel, un laborator crește embrioni de pește-zebră în apă albastră cu albastru de metilen încă din primele ore de viață, altul efectuează testul reglementat pe embrioni în apă limpede, iar ambele își numesc mediul normal. Oricine compară rezultate între laboratoare sau grupează date de control istorice preia această inconsecvență.

Pentru a pune concentrațiile în context, 0.00005% înseamnă aproximativ 1.56 micromolar, iar 0.0001%, aproximativ 3.13 micromolar. Aceste valori sunt mici și este tentant să le considerăm prea mici pentru a conta. Studiile de mai jos testează exact această presupunere, la exact aceste concentrații.

Cititorii familiarizați mai degrabă cu acvaristica decât cu laboratorul întâlnesc aceeași moleculă într-un alt context, prezentat în ghidul despre albastrul de metilen în acvarii. Chimia este aceeași; explicația modului în care colorantul transferă electroni în celule arată de ce un compus activ redox apare mereu în lucrările despre metabolism. Cele ce urmează se referă specific la apa pentru icrele de pește-zebră care conține albastru de metilen.

Metabolism: efectul își schimbă sensul în funcție de stadiu

Studiul cel mai informativ a expus pești-zebră cu dezvoltare normală din prima zi de viață până la 5 zile după fertilizare și a măsurat metabolismul oxidativ în fiecare stadiu, după cum descrie raportul publicat al experimentelor privind metabolismul embrionar. Tiparul merită prezentat cu atenție, deoarece își inversează direcția.

La 1 zi după fertilizare, consumul bazal de oxigen a crescut la embrionii expuși la ambele concentrații folosite în întreținere. La 2 zile, potențialul membranei mitocondriale din stratul superficial al larvelor a fost crescut la expuneri de 0.00005%, 0.0001% și 0.0003%. La 4 până la 5 zile, după eclozare, sensul efectului se inversase: consumul energetic oxidativ a scăzut, indiferent dacă expunerea fusese continuă de la fertilizare sau acută, doar din ziua 3 până în ziua 4. În paralel, nivelurile transcripților pentru subunitățile complexelor respiratorii mitocondriale au scăzut atât la 1 zi, cât și la 4 zile, împreună cu cele ale transcripților implicați în steroidogeneză și gluconeogeneză.

Încă două observații clarifică tabloul. Eclozarea a avut loc puțin mai devreme la concentrația mai mare folosită în întreținere: embrionii expuși erau în avans la 2 zile, iar controalele i-au ajuns din urmă până în ziua 3. În plus, axa de răspuns la stres în sine părea intactă: când larvele de 5 zile au fost supuse unui factor de stres prin agitare circulară, cortizolul măsurat la nivelul întregului organism a crescut normal în ambele grupuri. Așadar, la aceste doze, colorantul nu este un toxic general pentru dezvoltare și nu atenuează toate răspunsurile fiziologice. El modifică metabolismul energetic în funcție de stadiu: îl crește înainte de eclozare și îl reduce după.

Comportament: de ce două studii nu sunt de acord și de ce ambele pot avea dreptate

Literatura despre comportament pare contradictorie până când schemele de expunere sunt comparate direct. Un studiu privind siguranța dezvoltării și a comportamentului a expus embrioni începând de la aproximativ 6 ore după fertilizare la concentrații de până la 10 micromolar, a reînnoit soluțiile zilnic până în ziua 4, apoi a transferat larvele în mediu fără colorant pentru zilele 5 și 6 și a testat locomoția într-un test lumină-întuneric în ziua 6. Rezultatul: niciun efect semnificativ asupra mortalității, eclozării sau morfologiei și niciun efect al tratamentului asupra locomoției. Autorii au recomandat în mod rezonabil 10 micromolar ca limită superioară în condițiile lor.

Un al doilea grup, cu unii autori comuni studiului metabolic, a realizat expunerea așa cum se procedează efectiv în întreținere: colorant prezent începând de la 2 până la 3 ore după fertilizare, cu reînnoire parțială zilnică, iar comportamentul măsurat în timpul expunerii sau la scurt timp după aceasta. La aceleași concentrații de rutină, larvele au prezentat locomoție redusă într-un test de 24 de ore, rezultat reproductibil între linii și laboratoare, iar studiul privind factorii de confuzie comportamentali a asociat efectul cu tonusul serotoninergic, în concordanță cu inhibarea cunoscută a monoaminoxidazei de către colorant. Cel mai revelator, mediul embrionar care conținea albastru de metilen a mascat răspunsul locomotor așteptat la fluoxetină, un inhibitor selectiv al recaptării serotoninei (SSRI). Prin urmare, un test de screening efectuat în apă albastră poate rata un efect medicamentos pe care apa limpede l-ar evidenția.

Nu există o contradicție reală. Un compus poate să nu lase niciun efect rezidual detectabil la două zile după eliminarea prin spălare într-un test și să fie totuși activ cât timp este prezent în altul. Interpretarea practică este că rezultatul nul justifică o limită superioară a concentrației, nu o afirmație de neutralitate, în timp ce rezultatul pozitiv descrie riscul relevant: expunere activă în intervalul de măsurare, în exact configurația utilizată de majoritatea laboratoarelor.

Un colorant redox într-un test redox

Încă o capcană merită un paragraf separat, deoarece afectează instrumentul de măsurare, nu animalul. Testul Alamar Blue pentru consumul energetic se bazează el însuși pe chimie redox: resazurina este redusă la resorufină fluorescentă. Albastrul de metilen participă și el la reacții redox. În controalele fără celule, ambele concentrații folosite în întreținere au redus ușor, dar semnificativ, fluorescența Alamar Blue după 24 de ore. În experimentele pe animale, embrionii expuși au fost spălați de cel puțin trei ori în mediu fără colorant înainte de test, iar efectul biologic la larvele eclozate a depășit interferența observată în absența celulelor. Așadar, ambele lucruri sunt adevărate: animalele spălate prezintă un efect metabolic real, iar colorantul neîndepărtat prin spălare adaugă un artefact chimic direct. Controalele trebuie să le separe pe cele două; altfel, niciuna dintre valori nu are semnificație. Recomandările generale privind interpretarea rezultatelor testelor bazate pe coloranți se aplică aici cu o relevanță deosebită.

Cronologia stadiilor de dezvoltare

Materialul original pentru acest articol. Concentrațiile sunt cele două valori standard folosite în întreținere, 0.00005% și 0.0001%, dacă nu se precizează altfel.

Tiparul de reținut este o creștere timpurie și o scădere ulterioară a parametrilor metabolici, cu efecte comportamentale prezente în timpul expunerii și nedetectabile după eliminarea colorantului în singurul test care a evaluat acest lucru.

Listă de verificare pentru proiectarea controalelor

Al doilea material original. Folosiți-l atunci când protocoalele pentru pești-zebră cu albastru de metilen se intersectează cu un experiment.

1. Raportați colorantul ca reactiv, nu ca apă. Precizați concentrația atât în procente, cât și în micromolar, începutul și sfârșitul expunerii în ore sau zile după fertilizare, programul de reînnoire și intervalul de eliminare în mediu fără colorant înaintea fiecărei măsurători.
2. Adaptați controalele la întrebarea de cercetare. Un studiu al substanței chimice testate are nevoie de controale fără colorant; un studiu al întreținerii are nevoie de grupuri fără colorant și cu colorant, cu înregistrarea rezultatului antifungic, deoarece niciunul dintre studiile citate nu a măsurat eficacitatea antifungică.
3. Spălați înaintea testelor redox, apoi verificați. Clătiți de cel puțin trei ori în mediu fără colorant și includeți în paralel un control fără celule, cu colorant și reactiv, deoarece colorantul reduce direct semnalul Alamar Blue.
4. Considerați parametrii comportamentali și cei legați de monoamine ca având risc ridicat. Studiile privind locomoția, reacția de tresărire, comportamentele de tip anxios, antidepresivele și inhibitorii MAO trebuie să evite colorantul în timpul măsurării sau să demonstreze neutralitatea specifică parametrului evaluat; un interval de una până la două zile în mediu fără colorant a eliminat un efect locomotor, dar nu este validat pentru alte paradigme.
5. Considerați parametrii metabolici și mitocondriali ca având risc ridicat în fiecare stadiu. Consumul de oxigen, consumul energetic, potențialul membranei și transcripții lanțului respirator se modifică la concentrațiile folosite în întreținere, în direcții opuse înainte și după eclozare.
6. Nu extrapolați neutralitatea între scheme experimentale. Un rezultat nul după eliminarea colorantului nu acoperă expunerea în curs; un rezultat morfologic nul nu acoperă metabolismul sau interacțiunea cu medicamentele; un rezultat obținut pentru o anumită linie, temperatură sau durată a testului nu le acoperă pe celelalte.
7. Precizați ghidul urmat și alternativa sa. Menționați explicit concentrațiile CCAC, europene sau Cold Spring Harbor și semnalați că testul OECD pe embrioni omite colorantul, astfel încât cititorul să poată plasa animalele dumneavoastră în context.

Nimic din toate acestea nu pledează împotriva folosirii colorantului pentru a menține icrele în viață. Pledează împotriva includerii neexaminate în date a unei alegeri de întreținere. Albastrul din recipient este o moleculă cu proprietăți farmacologice, iar experimentele cel mai probabil să fie distorsionate sunt exact screeningurile metabolice și neurocomportamentale de mare capacitate pentru care peștii-zebră tineri sunt acum preferați. Consemnați-l, controlați-l experimental, eliminați-l prin spălare înainte de măsurare și verificați testul la care ar putea participa discret.