Porque é que o azul de metileno é utilizado como contracorante na coloração ácido-resistente

Um técnico examina um esfregaço de expetoração após a sequência completa de coloração. Bacilos vermelhos destacam-se sobre um campo azul, e o relatório é emitido como presença de bacilos ácido-resistentes. No dia seguinte, outra lâmina apresenta um campo azul uniforme, sem bacilos vermelhos, e é reportada como negativa para tuberculose. Um destes relatórios afirma mais do que a lâmina permite concluir, e não é a primeira vez que isso acontece.

A confusão é conceptual. O técnico tratou o corante azul como parte da química de deteção, como se o azul de metileno ajudasse a identificar as micobactérias. Não ajuda. Quando o azul de metileno entra em contacto com a lâmina, o teste já terminou. O corante apenas colore o fundo para tornar o resultado legível. Este artigo explica a finalidade do azul de metileno na coloração ácido-resistente, porque é azul em vez de ter outra cor e o que a presença de vermelho sobre azul permite concluir.

A resposta curta

A coloração ácido-resistente é um teste diferencial baseado em três ideias. A fucsina fenicada, o corante primário, é forçada a entrar em todas as células, incluindo as micobactérias de superfície cerosa. O álcool-ácido, o descolorante, remove o corante vermelho das células comuns, mas não consegue extraí-lo das células ácido-resistentes. O azul de metileno, o contracorante, colore depois tudo aquilo que o descolorante deixou sem cor, fazendo com que as células não ácido-resistentes, as células do hospedeiro e os detritos apareçam azuis, enquanto os bacilos ácido-resistentes permanecem vermelhos. O contracorante proporciona contraste. Não participa na química que torna uma célula ácido-resistente.

O que faz cada etapa

O diagrama abaixo mostra a divisão de funções. Leia-o da esquerda para a direita como um procedimento e interprete a faixa inferior como um lembrete de que cada família de colorações responde a uma pergunta diferente.

A penetração vem primeiro. As micobactérias resistem aos corantes aquosos comuns porque o seu invólucro é invulgarmente hidrofóbico, pelo que o protocolo força a entrada do corante. No método de Ziehl-Neelsen, o aquecimento com vapor conduz a fucsina fenicada contendo fenol através da parede cerosa. No método de Kinyoun a frio, o calor é substituído por uma formulação de corante primário muito mais forte, e algumas versões modificadas sem aquecimento adicionam tensioativos. Os protocolos de coloração ácido-resistente da American Society for Microbiology documentam ambas as formulações lado a lado, e a diferença de concentração é marcante: aproximadamente 0.3 g de fucsina básica por 100 mL no método com aquecimento, em comparação com cerca de 4 g no método a frio.

A diferenciação vem em segundo lugar. O álcool-ácido, normalmente 3 mL de ácido clorídrico concentrado em 97 mL de etanol a 95 por cento, remove o corante vermelho de todas as células cuja parede não oferece resistência especial. As células com o invólucro lipídico micobacteriano intacto retêm o corante. Esta é a etapa de que depende todo o método e a mais sensível à técnica, como se explica abaixo.

O contraste vem por último. A lâmina contém agora células ácido-resistentes vermelhas sobre um fundo quase incolor de células descoloradas. O azul de metileno a 0.3 por cento p/v devolve visibilidade a esse fundo numa cor o mais distante possível do vermelho. A contracoloração é breve, normalmente 20 a 30 segundos no método com aquecimento e até alguns minutos em determinadas variantes do método a frio, sendo o tempo dependente do protocolo e não uma propriedade do próprio corante.

Porquê este corante e porquê azul

O azul de metileno é um corante básico catiónico, o que significa que o seu ião colorido possui carga positiva e se liga às superfícies com carga negativa de bactérias descoloradas, células do hospedeiro e detritos. O OpenStax Microbiology descreve esta lógica de cargas como o princípio geral subjacente aos corantes básicos. No entanto, o azul de metileno não é quimicamente único neste contexto. O violeta de cristal e a safranina também são corantes básicos. A escolha é ótica, não química.

Os bacilos vermelhos precisam de um fundo com uma tonalidade contrastante, e o azul oferece uma oposição ao vermelho particularmente útil em microscopia de campo claro. A safranina seria um contracorante inadequado porque o seu resultado final rosa-avermelhado fica demasiado próximo da fucsina fenicada retida, eliminando a própria distinção criada pelo procedimento. O violeta de cristal produziria um fundo violeta escuro que competiria visualmente com os bacilos vermelhos finos. A evidência mais forte de que a função é o contraste, e não a química, é a possibilidade de substituição: contracorantes verdes, como o verde de malaquite e o verde brilhante, são utilizados em alguns protocolos veterinários e modificados, e o teste continua a funcionar porque qualquer tonalidade claramente diferente cumpre a mesma função.

Daqui resultam duas consequências práticas. Primeiro, a receita padrão não especifica qualquer ajuste de pH; não confunda esta solução aquosa simples a 0.3 por cento com formulações alcalinas como o azul de metileno de Loeffler, que pertencem a um conceito de coloração diferente. Segundo, o excesso prejudica. A literatura de histologia alerta especificamente que um fundo azul excessivamente intenso pode ocultar bacilos escassos, pelo que manter a lâmina coberta pelo corante durante mais tempo do que o protocolo permite reduz a legibilidade sem qualquer benefício.

A química da parede que torna o teste possível

A razão pela qual o álcool-ácido permite a diferenciação reside no invólucro micobacteriano. O seu núcleo estrutural é o complexo micolil-arabinogalactano-peptidoglicano: peptidoglicano ligado a arabinogalactano, cujas extremidades externas transportam ácidos micólicos de cadeia muito longa, formando uma micomembrana externa rica em lípidos e com permeabilidade invulgarmente baixa. A revisão sobre a membrana externa micobacteriana descreve esta arquitetura em detalhe. A barreira funciona nos dois sentidos. Resiste à entrada do corante, razão pela qual a penetração exige calor ou um corante primário reforçado, e resiste à extração do corante, razão pela qual o álcool-ácido não consegue remover a fucsina fenicada depois de esta entrar. As bactérias comuns não possuem este invólucro e perdem o corante. A ácido-resistência é, portanto, mais bem compreendida como um fenómeno de barreira lipídica, e não como uma ligação química da fucsina ao ácido micólico.

Esta química também explica uma dúvida comum: as micobactérias coram-se de forma deficiente e imprevisível pelo método de Gram, surgindo por vezes como formas ténues e granulares ou como silhuetas não coradas. A sua parede hidrofóbica limita a penetração do violeta de cristal. A coloração ácido-resistente não é uma coloração de Gram modificada. É um princípio diferencial distinto, baseado numa propriedade diferente da parede, como mostra a comparação entre coloração simples e coloração de Gram para os outros dois métodos.

Três métodos, três perguntas

Para a família mais ampla de métodos bacterianos com um único corante, consulte o atlas de colorações para microscopia.

O que o vermelho sobre azul não pode demonstrar

Bacilos vermelhos significam que os organismos retiveram a fucsina fenicada durante a exposição ao álcool-ácido. Esse achado é compatível com Mycobacterium tuberculosis, mas as orientações do CDC para diagnóstico da tuberculose indicam explicitamente que outras micobactérias também são ácido-resistentes, pelo que a identificação da espécie exige cultura e testes de ácidos nucleicos, não apenas a cor.

Os erros técnicos concentram-se nas duas lavagens. Uma descoloração insuficiente deixa material de fundo vermelho e favorece leituras falsamente positivas. Uma descoloração excessiva remove corante primário retido de forma mais fraca e contribui para falsos negativos. Um contracorante aplicado em excesso pode ocultar bacilos escassos no azul. Esfregaços espessos, reagentes precipitados e água de lavagem contaminada introduzem artefactos adicionais.

A sensibilidade é limitada pela carga de organismos, independentemente da qualidade da técnica. A microscopia convencional de esfregaço necessita de aproximadamente 5,000 a 10,000 bacilos por mililitro de expetoração, e revisões mais antigas de evidência do CDC situaram a sensibilidade do esfregaço em cerca de 45 a 80 por cento entre casos pulmonares confirmados por cultura. Por isso, um esfregaço negativo nunca exclui tuberculose. As orientações atuais do CDC mantêm a cultura em conjunto com todos os esfregaços e recomendam testes de amplificação de ácidos nucleicos em pelo menos uma amostra respiratória quando se considera tuberculose pulmonar e o resultado possa alterar a abordagem clínica.

O trabalho prático deve seguir protocolos autorizados

Descrições pedagógicas, incluindo este artigo, não autorizam trabalho clínico. Para trabalho de bancada, siga o procedimento operacional padrão validado do laboratório, alinhado com os documentos atuais do CDC, APHL ou CLSI; a referência do CDC sobre coloração ácido-resistente disponível no arquivo Stacks mostra como esses procedimentos especificam reagentes e critérios de leitura. O trabalho com amostras de tuberculose exige contenção: os esfregaços são preparados numa câmara de segurança biológica porque a preparação gera aerossóis e salpicos, e as orientações de segurança laboratorial do CDC indicam que mesmo esfregaços fixados pelo calor podem conter bacilos tuberculosos viáveis e devem continuar a ser tratados como contaminados. A entrada da CDC Public Health Image Library para um esfregaço com fucsina fenicada e azul de metileno examinado para M. leprae é um lembrete útil da aplicação do método para além da tuberculose: o mesmo contraste de vermelho sobre azul é utilizado sempre que se procuram organismos ácido-resistentes, e uma leitura negativa efetuada cuidadosamente é, por si só, um resultado que deve ser registado.

Leitura da lâmina concluída

O contracorante demonstra a sua utilidade durante o rastreio. Ao examinar inicialmente a baixa ampliação, o microscopista utiliza primeiro o fundo azul para avaliar a qualidade do esfregaço: distribuição uniforme das células, células do hospedeiro intactas para focagem e ausência de precipitado abundante. Os candidatos vermelhos atraem então a atenção precisamente porque mais nada na lâmina é vermelho. A confirmação é feita com imersão em óleo, em que os verdadeiros bacilos apresentam a forma esperada de bastonetes finos, por vezes ligeiramente curvos ou granulares, em vez de detritos de corante uniformes.

A coloração do fundo também define o vocabulário utilizado no relatório. Uma lâmina com bacilos vermelhos é reportada como presença de bacilos ácido-resistentes, muitas vezes com uma classificação semiquantitativa segundo a escala do laboratório. Uma lâmina sem organismos vermelhos é reportada como ausência de bacilos ácido-resistentes, nunca como negativa para tuberculose. A distinção é importante porque o campo azul demonstra que a coloração funcionou, que as células incorporaram o contracorante e que as condições óticas eram adequadas, sem fornecer qualquer informação sobre organismos abaixo do limite de deteção. Um campo azul sem bacilos é um resultado válido sobre a lâmina, não uma conclusão sobre o doente.

Basta recordar a divisão de funções para que os relatórios se tornem claros. A fucsina fenicada assinala os candidatos. O álcool-ácido executa o teste. O azul de metileno apenas torna a resposta legível: o vermelho reteve o corante perante o ácido, o azul perdeu-o. Tudo o resto — espécie, carga e significado clínico — depende de trabalho realizado para além da lâmina. :::