Novo azul de metileno e coloração de reticulócitos: um corante distinto e um método com células vivas

Um estudante prepara uma contagem de reticulócitos, encomenda azul de metileno, mistura-o com sangue e praticamente não vê nada. Um colega utiliza um frasco rotulado como novo azul de metileno e obtém filamentos azuis nítidos no interior de uma fração dos glóbulos vermelhos. O primeiro estudante presume que o segundo frasco é mais recente ou mais concentrado. Não é nenhuma dessas coisas. Contém uma molécula diferente.

Este é o erro conceptual que está por detrás da maior parte da confusão nesta área. O nome sugere que o novo azul de metileno é uma versão melhorada do azul de metileno. A química mostra o contrário. O novo azul de metileno N é um corante de fenotiazina distinto, com o seu próprio número no Colour Index, o seu próprio padrão de substituição e a sua própria função normalizada em hematologia. Assim que esta distinção fica clara, o resto do método (por que motivo as células têm de estar vivas quando são coradas, o que conta como reticulócito, onde se enquadram os corpos de Heinz e quando entra em cena o azul de cresil brilhante) torna-se simples.

A resposta curta

O novo azul de metileno N, o reagente de hematologia, é geralmente identificado como Basic Blue 24 no registo do PubChem para novo azul de metileno, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, fórmula C18H22ClN3S. O azul de metileno comum é cloreto de metiltionínio, Basic Blue 9, no respetivo registo do PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, fórmula C16H18ClN3S. Estruturalmente, o novo azul de metileno apresenta dois grupos metilo no anel e cadeias laterais etilamino onde o azul de metileno apresenta grupos dimetilamino. Essa diferença altera o comportamento de coloração. Os textos de hematologia descrevem o azul de metileno comum como um corante relativamente fraco para reticulócitos e o novo azul de metileno como produzindo uma coloração mais intensa e uniforme, uma comparação resumida no tópico da ScienceDirect sobre novo azul de metileno.

Sim, o novo azul de metileno é um corante supravital. Coloração supravital significa corar células vivas depois de serem removidas do organismo e antes da fixação, conforme definido na revisão do NCBI sobre os princípios da coloração supravital. Tanto o novo azul de metileno como o azul de cresil brilhante pertencem a esta categoria, e a norma CLSI para reticulócitos abrange explicitamente o novo azul de metileno como corante supravital. Por vezes, os estudantes agrupam este método com a coloração de Romanowsky de esfregaços fixados. Esse modelo mental não funciona aqui. Fixar primeiro faz com que o método deixe de funcionar.

Para os leitores que acompanham nomes de corantes semelhantes, azul de metilo versus azul de metileno aborda uma confusão diferente e mais ampla entre um corante triarilmetano aniónico e a família catiónica das fenotiazinas. A visão geral da coloração laboratorial situa o trabalho supravital entre os métodos com esfregaços fixados, e o guia de morfologia das células sanguíneas mostra onde a avaliação de reticulócitos se enquadra no diferencial mais amplo.

Uma precaução de catálogo: existe uma forma distinta de sal duplo de cloreto de zinco do novo azul de metileno com o CAS 6586-05-6. Por isso, uma secção de métodos deve indicar a forma salina e o fornecedor, e não apenas o nome comum.

O que a coloração supravital faz realmente

Um reticulócito é um glóbulo vermelho jovem que perdeu o núcleo, mas conserva RNA ribossómico residual. Numa preparação húmida não corada, esse RNA é invisível. O corante supravital entra na célula viva e precipita ou agrega esse RNA em grânulos e filamentos azuis, o material reticulofilamentoso observado sob imersão em óleo. A rede é, portanto, um produto da coloração, e não um esqueleto pré-formado à espera de cor. É por isso que as variáveis do protocolo (concentração do corante, tampão, proporção entre sangue e corante, temperatura, tempo) são tão importantes como o nome do corante.

A consequência prática é uma ordem de operações rigorosa: primeiro, misturar o sangue anticoagulado com o corante, incubar e, depois, preparar os esfregaços e examiná-los sem fixação e sem contracoloração. A fixação antes da coloração, ou uma contracoloração que oculte filamentos ténues, destrói a informação de que depende a contagem.

Um protocolo funcional para reticulócitos com novo azul de metileno

Não existe uma formulação universal única, pelo que deve ser indicada a formulação utilizada. Três variantes documentadas mostram o intervalo possível.

O procedimento clássico do tipo Brecher utiliza aproximadamente 0.5 percent de novo azul de metileno com oxalato de potássio, misturado em volumes iguais com sangue em EDTA bem homogeneizado e incubado durante cerca de 10 a 15 minutos à temperatura ambiente. Após uma nova mistura suave, preparam-se esfregaços finos em cunha, deixam-se secar ao ar e examinam-se sem fixação sob a objetiva de imersão em óleo de 100x. O procedimento do NCBI para contagem de reticulócitos descreve este fluxo de trabalho e a grelha de contagem utilizada com ele.

A variante de Dacie e Lewis utiliza 1.0 percent de novo azul de metileno em solução salina com citrato, misturado com 2 a 4 volumes de sangue e mantido a 37 C durante 15 a 20 minutos antes da preparação dos esfregaços. Uma implementação recente de harmonização do procedimento CLSI H44 utilizou uma solução mais diluída de 0.1 percent em solução salina tamponada com fosfato a pH 7.4, com incubação a 20 C durante 10 minutos e sem fixação, conforme descrito no estudo de harmonização de NMB de 2026.

As regras de contagem são comuns às diferentes variantes. Classifique uma célula como reticulócito quando contiver pelo menos dois grânulos distintos de coloração azul ou segmentos de filamentos, o que exclui depósitos isolados de corante. Conte pelo menos 1,000 glóbulos vermelhos no trabalho de rotina e indique os reticulócitos como percentagem. Com percentagens baixas, a estatística exige mais células. Uma revisão da metodologia CLSI H44 observa que, perto de 1 percent de reticulócitos, são necessárias cerca de 4,400 células para reduzir a variação da contagem para 5 percent, na revisão CLSI H44 da De Gruyter. Um disco ocular de Miller torna práticas as contagens elevadas. Filtre o corante ou prepare-o de fresco, porque o precipitado pode imitar inclusões granulares.

Corpos de Heinz na mesma preparação

O mesmo esfregaço supravital também pode demonstrar corpos de Heinz, que são agregados de hemoglobina oxidada e desnaturada, e não RNA residual. Em preparações com novo azul de metileno, aparecem como corpos arredondados, frequentemente únicos e próximos da membrana, corando de azul mais claro do que o material reticulofilamentoso. Sobrevivem mal à fixação e à contracoloração, pelo que o esfregaço deve ser examinado sem fixação. Um protocolo recente que utilizou 20 microliters de sangue em EDTA com 20 microliters de novo azul de metileno a 1 percent e 15 minutos de incubação quantificou células positivas para corpos de Heinz entre 250 eritrócitos, no estudo do PMC que descreve esse procedimento.

Duas distinções evitam interpretações incorretas. Primeiro, o violeta de metilo e o violeta de cristal coram os corpos de Heinz com maior intensidade do que o novo azul de metileno, conforme indicado no tópico da ScienceDirect sobre corpos de Heinz. O novo azul de metileno é a escolha conveniente quando se avaliam reticulócitos e corpos de Heinz em conjunto, não o corante dedicado mais intenso para corpos de Heinz. Segundo, as inclusões de HbH no traço de alfa-talassemia produzem numerosos pontos finos por toda a célula após coloração supravital, enquanto os corpos de Heinz clássicos são menos numerosos, maiores e frequentemente associados à membrana. O depósito de corante é o terceiro elemento que pode ser confundido: encontra-se fora do plano focal das células e varia entre campos.

Azul de cresil brilhante versus novo azul de metileno

Ambos os corantes são corantes supravitais para reticulócitos, mas a normalização favorece um deles. O método CLSI H44-A2 para reticulócitos, desenvolvido em conjunto com o International Council for Standardization in Haematology e indicado na página da norma CLSI H44, designa a coloração com novo azul de metileno de sangue em EDTA como método comparativo manual. O ensino clássico de hematologia concorda quanto ao aspeto: o novo azul de metileno produz coloração dos filamentos mais intensa e uniforme, enquanto o azul de cresil brilhante apresenta maior variação entre lotes e amostras.

Esse estatuto requer uma ressalva. A diretriz ICSH para avaliação de analisadores aceita a microscopia manual com novo azul de metileno como abordagem de comparação de referência, mas considera-a subjetiva e relativamente imprecisa, dando preferência a procedimentos de referência por citometria de fluxo quando disponíveis. Uma comparação de 2022 com 100 amostras encontrou menor viés relativamente ao respetivo analisador com azul de cresil brilhante do que com novo azul de metileno, conforme relatado na comparação de métodos de coloração no PMC. O resumo defensável para estudantes é: utilizar novo azul de metileno como comparador manual normalizado, verificar qualquer método local com azul de cresil brilhante em relação a este ou à automatização e esperar maior dispersão com microscopia manual em qualquer dos casos. A literatura mais antiga sobre normalização também defendeu Azure B purificado como alternativa quimicamente mais limpa porque os lotes comerciais de corante variavam, no estudo de Marshall sobre Azure B, o que explica por que motivo o grau do reagente continua a surgir nas discussões sobre métodos.

Evitar os erros mais comuns

Quatro erros são responsáveis pela maioria das preparações falhadas. Encomendar azul de metileno comum em vez de novo azul de metileno N produz uma coloração fraca devido à química, e não à técnica. Fixar ou contracorar antes da leitura elimina o sinal supravital. Contar precipitado de corante como grânulos aumenta artificialmente o resultado, algo que a regra dos dois grânulos e o corante filtrado ajudam a evitar. Contar poucas células quando a percentagem de reticulócitos é baixa produz um número que parece preciso, mas com limites de confiança amplos. Cada erro tem a mesma assinatura: o microscopista culpa o microscópio pelo que foi determinado na etapa do reagente. :::