Medir os efeitos mitocondriais do azul de metileno: oxigénio, ATP e potencial de membrana

Suponha que um laboratório adiciona azul de metileno a mitocôndrias com a respiração comprometida e observa um aumento do consumo de oxigénio. A conclusão natural seria escrever que o corante restaurou a função mitocondrial. Essa conclusão pode estar errada. O fluxo de oxigénio, a síntese de ATP e o potencial de membrana são três conceitos distintos. Partilham o mesmo organelo da mesma forma que cópia de segurança, sincronização e partilha usam a mesma pasta na nuvem: estão relacionados, mas são regidos por regras diferentes. Confundir um com outro compromete a interpretação, mesmo quando todas as medições estão tecnicamente corretas.

O azul de metileno torna esta confusão particularmente provável porque participa no sistema que está a ser medido. É um agente de ciclagem redox que aceita eletrões a montante e os doa a jusante, um catião lipofílico que se acumula em mitocôndrias energizadas e um composto de azul intenso que absorve e emite luz nas mesmas bandas que sondas comuns. Uma única leitura não consegue suportar toda essa carga interpretativa. O padrão fiável, demonstrado nos estudos mitocondriais de Budapeste, consiste em medir o fluxo de oxigénio, a taxa de síntese de ATP, o potencial de membrana e a libertação de peróxido de hidrogénio, com controlos específicos para o corante em cada etapa.

A respirometria mede o fluxo de oxigénio, não a produção de energia

A respirometria de alta resolução, seja através do Oroboros Oxygraph ou de um analisador de fluxo extracelular Seahorse, indica uma coisa: a velocidade a que o oxigénio está a ser reduzido. Não indica quantos protões foram bombeados por eletrão, quanto do gradiente foi conservado nem se a ATP sintase o utilizou.

A terminologia é importante. Em mitocôndrias isoladas, substrato sem ADP produz respiração de fuga, substrato com ADP saturante produz capacidade de fosforilação oxidativa e a titulação de desacoplador fornece a capacidade máxima de transferência de eletrões. Em células intactas, os equivalentes no Seahorse são respiração basal, respiração associada ao ATP e sensível à oligomicina, fuga de protões, respiração máxima definida por FCCP e consumo de oxigénio não mitocondrial resistente a rotenona mais antimicina. Chamar aos resultados do Seahorse Estado 3 e Estado 4 atribui uma precisão que a preparação não suporta, como deixa claro o enquadramento do Agilent Mito Stress Test.

O azul de metileno quebra a associação intuitiva entre mais oxigénio e mais energia. Em mitocôndrias isoladas de cérebro de cobaia, 100 nM a 1 uM de corante aumentaram o consumo de oxigénio em repouso com substratos de glutamato mais malato, succinato e alpha-glicerofosfato, com um aumento de aproximadamente 64 percent com alpha-glicerofosfato, enquanto a respiração estimulada por ADP em mitocôndrias saudáveis permaneceu praticamente inalterada, segundo o estudo de mitocôndrias cerebrais isoladas. Como a fuga aumentou enquanto o fluxo estimulado por ADP permaneceu estável, o rácio de controlo respiratório calculado diminui. Essa diminuição não significa que o corante tenha danificado as mitocôndrias. Significa que o corante acrescentou um ciclo redox consumidor de oxigénio à respiração normal. Um ensaio de consumo de oxigénio com azul de metileno que reporte apenas o aumento mediu química real e não disse nada sobre conservação de energia.

As experiências de recuperação mostram a mesma diferença a uma escala maior. Com o Complexo I bloqueado, o fluxo de oxigénio recuperou aproximadamente três vezes, enquanto a síntese de ATP recuperou apenas cerca de 1.5 vezes. Mais oxigénio chegou ao elétrodo. Uma fração menor contribuiu para produzir ATP. Qualquer alegação de melhoria da fosforilação oxidativa necessita do lado do ATP na análise, idealmente expresso como um rácio de ATP por oxigénio, com a convenção utilizada no denominador explicitada.

Os ensaios de ATP medem a taxa de síntese, que não pode ser substituída pelo conteúdo

Um ensaio de ATP responde a uma pergunta diferente: quanto ATP é gerado por unidade de tempo. Uma leitura cinética, seja através da luminescência da luciferase de pirilampo acompanhada durante vários minutos ou de um ensaio acoplado de hexocinase mais glucose-6-fosfato desidrogenase lido a 340 nm, fornece uma taxa. Uma única medição de ponto final do ATP total fornece conteúdo, que reflete síntese menos consumo e, por si só, diz pouco sobre a fosforilação oxidativa.

O grupo de Budapeste utilizou o método enzimático acoplado com a adenilato cinase suprimida e verificou que o azul de metileno a 1 a 2 uM aumentava de forma modesta mas significativa a produção de ATP em mitocôndrias tratadas com rotenona e com antimicina. Trata-se de uma recuperação real e parcial. O estudo de toxicidade do TEGDMA chegou a um resultado com o mesmo padrão num modelo diferente: 5 mM do monómero dentário TEGDMA reduziram a respiração associada ao Complexo I de aproximadamente 286 para 28 unidades de fluxo, e 2 uM de corante restauraram-na para aproximadamente 86.

Dois controlos são indispensáveis com um composto redox colorido. Primeiro, utilize oligomicina para determinar quanto da síntese de ATP medida depende da ATP sintase. Segundo, execute uma recuperação de adição em sistema acelular com ATP conhecido, reagente completo e as concentrações exatas de corante utilizadas, no mínimo 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM e 2 uM. O corante pode absorver a luz emitida, inibir a enzima repórter ou alterar a química redox dos reagentes, e as orientações gerais para ensaios de luciferase recomendam contraensaios bioquímicos precisamente para esta classe de interferência. Não presuma que 1 uM está isento de artefactos apenas porque a extinção tende a ser pior em concentrações mais elevadas.

As sondas de potencial de membrana medem a distribuição do corante, não o fluxo

Safranina O, TMRM e TMRE, rodamina 123 e JC-1 são todos catiões permeáveis à membrana. Acumulam-se na matriz com carga negativa de acordo com o equilíbrio eletroquímico, pelo que a fluorescência global indica indiretamente o potencial através da localização da sonda. Nenhuma destas sondas mede ATP nem fluxo de eletrões.

Cada sonda tem uma preparação preferencial. A Safranina O é adequada para mitocôndrias isoladas e células permeabilizadas, normalmente perto de 2 uM, com excitação perto de 495 nm e emissão perto de 585 nm, funcionando num regime de extinção em que a captação altera a fluorescência global. TMRM e TMRE são adequadas para células intactas com carregamento nanomolar baixo em modo sem extinção, no qual a despolarização liberta o corante e a fluorescência mitocondrial diminui; com carregamento elevado, a direção do sinal pode inverter-se devido à autoextinção. JC-1 fornece um rácio conveniente de verde para vermelho, mas depende do carregamento e da massa mitocondrial, o que o torna menos adequado para trabalho quantitativo do que TMRM cuidadosamente controlado. Estes compromissos são resumidos numa revisão amplamente utilizada sobre sondas de potencial de membrana mitocondrial.

O azul de metileno interfere opticamente precisamente nas concentrações de trabalho. As suas bandas de absorção perto de 600 a 665 nm sobrepõem-se à emissão das sondas vermelhas, pelo que efeitos de filtro interno, extinção e absorção da luz de excitação são todos plausíveis. O corante é também um segundo catião lipofílico cuja própria distribuição muda em função do potencial que está a ser medido. A defesa consiste em redundância e brancos: sonda isolada, corante isolado, sonda mais cada concentração de corante, despolarização completa com FCCP como referência zero e, idealmente, uma segunda sonda opticamente distinta. O estudo de desvio do Complexo III estabeleceu esse precedente ao repetir a recuperação do potencial de membrana com Safranina O e TMRM após inibição com antimicina e myxothiazol, obtendo a mesma recuperação qualitativa. Um repórter ótico é um indício. Dois repórteres independentes constituem evidência.

Três preparações, três perguntas diferentes

Mitocôndrias isoladas, células permeabilizadas e células intactas não são definições de sensibilidade intercambiáveis num único ensaio. São conceitos diferentes com princípios operacionais distintos.

As mitocôndrias isoladas preservam a cadeia de transporte de eletrões, a membrana interna e a maquinaria da matriz, removendo simultaneamente a membrana plasmática, o citosol e a arquitetura da rede. Essa remoção é precisamente o objetivo: substratos, ADP, inibidores e concentrações de corante são definidos com exatidão, permitindo atribuir uma via. O custo é a perda do fornecimento nativo de substratos, da sinalização e da procura energética.

As células permeabilizadas mantêm as mitocôndrias inseridas em grande parte da sua arquitetura celular, permitindo simultaneamente a passagem de substratos exógenos e ADP através da membrana plasmática aberta. São a ferramenta adequada para atribuir um defeito de uma via de substrato num contexto celular. A permeabilização excessiva danifica a membrana externa e a regulação citosólica perde-se por lavagem.

As células intactas preservam tudo: barreira da membrana plasmática, redutores citosólicos, transporte endógeno de substratos, rede mitocondrial e procura de ATP. São as mais próximas da fisiologia e as mais distantes do mecanismo, porque a captação, redução e sequestração do corante determinam também a exposição mitocondrial efetiva.

O estudo com TEGDMA utilizou deliberadamente os três níveis: mitocôndrias cerebrais isoladas para avaliar a recuperação da oxidação e do potencial pelo corante, células estaminais da polpa dentária permeabilizadas sobretudo para localizar a lesão na oxidação de substratos associada ao Complexo I, e células estaminais intactas para avaliar o efeito fisiológico líquido de 2 uM de corante sobre o consumo de oxigénio suprimido. Para leitores que comparem leituras mitocondriais entre preparações, o guia complementar sobre como o azul de metileno transfere eletrões através da cadeia respiratória fornece o contexto da via, e o guia para interpretar estudos de respiração com azul de metileno aborda a lógica de dose e inibidores.

Controlos exigidos por um corante com atividade redox

Um agente de ciclagem redox exige uma lista de controlos mais extensa do que um inibidor comum, porque a química do corante isolado pode imitar a biologia.

Para respirometria, utilize uma câmara apenas com tampão para avaliar deriva, uma câmara com tampão mais corante sem material biológico, corante mais qualquer redutor extracelular presente no ensaio e rotenona terminal mais antimicina para definir o consumo de oxigénio não mitocondrial em células intactas. Tenha em conta que o corante reduzido volta a oxidar-se ao transferir eletrões para o oxigénio para formar peróxido de hidrogénio, pelo que um branco apenas com corante, sem dador de eletrões, subestima o sumidouro acelular de oxigénio que surge quando NADH ou NADPH estão disponíveis.

Para peróxido de hidrogénio, prefira Amplex UltraRed calibrado mais peroxidase de rábano a corantes DCFDA não seletivos, confirme com catalase e teste a dependência da iluminação, uma vez que o corante é fotossensibilizador. O estudo de mitocôndrias cerebrais verificou que a carga de peróxido aumentou mais de quatro vezes com apenas 100 nM de corante, enquanto a eliminação abrandou, com peróxido formado diretamente pelo corante reduzido sem um intermediário de superóxido. Os detalhes da escolha de sondas e dos controlos de luz encontram-se no artigo complementar sobre medição de espécies reativas de oxigénio em experiências com corantes, e a questão mais ampla de quando o peróxido atua como sinal ou como carga é abordada juntamente com o equilíbrio redox celular e as alegações sobre antioxidantes.

Para alegações relacionadas com vias, teste ambos os locais inibidores do Complexo III: antimicina A no local Qi e myxothiazol no local Qo, além de um ponto final do Complexo IV com cianeto. Um estudo anterior em cérebro de ratinho relatou recuperação, pelo corante, da respiração bloqueada por rotenona, mas não da respiração bloqueada por antimicina, enquanto o estudo posterior realizado em três espécies encontrou recuperação parcial com ambos os inibidores e indícios de redução direta do citocromo c. Considere o desvio compatível com os dados mais recentes, e não como algo definitivamente estabelecido, uma vez que a concentração de corante, o local do inibidor, o estado do substrato e a distribuição do corante alteram todos a via observada.

Matriz de seleção de ensaios

Utilize esta tabela para escolher a medição a partir da pergunta, e não o contrário.

A alegação minimamente convincente utiliza as mesmas concentrações de corante, 100 nM, 300 nM, 1 uM e 2 uM, para medir o fluxo de oxigénio em condições de fuga, ADP, oligomicina e desacoplador, a taxa de síntese de ATP, o potencial de membrana, de preferência com duas sondas, e a libertação calibrada de peróxido com catalase e controlos acelulares. Reporte o conjunto associado: fluxo de oxigénio mais taxa de ATP mais ATP por oxigénio mais potencial mais peróxido. Qualquer um destes números, isoladamente, é uma medição à procura de significado. :::