Medição de espécies reativas de oxigénio em experiências com azul de metileno

Dois laboratórios realizam aquilo a que cada um chama uma experiência sobre a ação antioxidante do azul de metileno. Um relata que o corante suprime espécies reativas de oxigénio. O outro relata que as gera. Ambos apresentam curvas dose-resposta nítidas. Ambos são rigorosos. A diferença não resulta de fraude nem de incompetência. Resulta do facto de os dois grupos terem medido coisas diferentes sob condições de iluminação diferentes, com sondas que respondem a perguntas diferentes, e depois terem descrito ambas as respostas com a mesma palavra: ROS.

O azul de metileno é uma molécula difícil de medir com precisão porque participa na química que supostamente deveria observar. No escuro, transfere eletrões entre dadores e aceitadores e regressa à sua forma inicial, pronta para reiniciar o ciclo. Sob luz, torna-se um fotossensibilizador, atingindo um estado tripleto excitado a partir do qual pode transferir energia para o oxigénio e produzir oxigénio singuleto, ou transferir eletrões para formar radicais e peróxido de hidrogénio. Qualquer sonda colocada nesse sistema pode ser oxidada, reduzida, fotobranqueada ou ter o seu sinal ótico mascarado pelo próprio corante. Por isso, a primeira pergunta perante qualquer leitura de ROS nunca é qual é o valor. É o que o ensaio realmente deteta e o que o corante faz ao ensaio.

Amplex Red: um ensaio calibrado de peróxido de hidrogénio

A combinação de azul de metileno e Amplex Red é a associação mais defensável nesta literatura, quando corretamente configurada. A química é específica: a peroxidase de rábano utiliza peróxido de hidrogénio para oxidar o substrato Amplex num produto fluorescente, resorufina, numa estequiometria aproximadamente um para um. O peróxido da amostra transforma-se em fluorescência no detetor. Nenhum outro membro da família canónica das ROS promove diretamente essa reação.

A vantagem decisiva é a calibração. Um operador cuidadoso utiliza padrões conhecidos de peróxido no mesmo tampão, com as mesmas concentrações de peroxidase e substrato, o mesmo tempo de incubação e as mesmas definições óticas, e depois compara as amostras com essa curva. No estudo com mitocôndrias cerebrais isoladas que constitui a principal referência deste método, os autores fizeram exatamente isso, adicionando quantidades conhecidas de peróxido no final de cada ensaio, e os valores são apresentados como taxas em picomoles por minuto por miligrama de proteína, em vez de unidades arbitrárias de fluorescência. É isso que transforma um brilho numa medição.

Três detalhes desse estudo merecem ser reproduzidos. Primeiro, os autores verificaram o sinal com catalase, que destrói o peróxido. O aumento de fluorescência induzido pelo azul de metileno parou quando foi adicionada catalase, confirmando que o sinal correspondia a peróxido e não a um artefacto ótico. Segundo, testaram diretamente a iluminação fechando o obturador do feixe de excitação, de modo que as amostras recebessem um oitavo da dose normal de luz, e o sinal diminuiu apenas nove por cento. Mais de noventa por cento do peróxido relatado era independente da luz utilizada na medição. Terceiro, mediram separadamente a eliminação do peróxido com um elétrodo e verificaram que o corante aumentava simultaneamente a produção e abrandava a depuração. Uma sonda que apenas registasse fluorescência líquida teria confundido esses dois efeitos.

O ensaio continua a ter modos de falha, e o azul de metileno encontra vários deles. O corante absorve intensamente na mesma região vermelha em que a resorufina emite, pelo que, em concentrações elevadas de corante, a amostra pode mascarar o próprio sinal através de efeitos de filtro interno. Por isso, os padrões devem conter a mesma concentração de corante que as amostras. O Amplex Red também pode sofrer foto-oxidação por si só, e o seu produto, a resorufina, pode entrar em ciclos fotoredox que geram superóxido e peróxido, algo especialmente importante quando a experiência também ilumina um fotossensibilizador. A solução prática consiste em irradiar primeiro as amostras de azul de metileno e analisar alíquotas com reagentes Amplex no escuro, em vez de iluminar simultaneamente o corante e a sonda. Por fim, a superóxido dismutase não reduz simplesmente um sinal Amplex: a conversão de superóxido em peróxido pode aumentá-lo. Um controlo com SOD que aumente a fluorescência não falhou. Identificou o superóxido como espécie a montante.

DCFDA: um indicador inespecífico de oxidação

A combinação de azul de metileno e DCFDA está na origem da maior parte da confusão. O DCFH-DA é um precursor utilizado para carregar células. As esterases no interior da célula removem os seus grupos acetato, deixando DCFH não fluorescente, e a oxidação do DCFH produz DCF fluorescente. A lista do que o oxida é extensa: radicais hidroxilo, intermediários de peroxidase e heme, dióxido de azoto, ácido hipocloroso e radicais derivados do peroxinitrito. O peróxido de hidrogénio, por si só, não o oxida diretamente a uma velocidade útil; a fluorescência dependente de peróxido necessita geralmente de ferro, proteínas heme ou química de peroxidase no circuito.

A crítica que todas as secções de métodos deveriam citar provém da análise do DCFH como sonda por Kalyanaraman e colegas, conforme resumido no estudo sobre mitocôndrias cerebrais que rejeitou o DCFDA por esta razão, que mostrou que o corante reage lentamente, com estequiometria não caracterizada, sem calibração válida e também com compostos que não são ROS. A sonda também amplifica aquilo que mede: a oxidação de um eletrão do DCFH produz um radical DCF que reage com oxigénio para formar superóxido, que sofre dismutação e origina peróxido adicional. A própria leitura fabrica parcialmente a química que relata.

Nada disto torna o DCFDA inútil. Torna-o um método de rastreio, não de identificação. Um aumento da fluorescência de DCF significa que aumentou a oxidação da sonda dependente de oxidantes. Não significa que o peróxido aumentou e certamente não significa que o total de ROS aumentou, uma grandeza que nenhuma sonda isolada mede. Trabalhos anteriores sobre azul de metileno que se basearam na oxidação de DCF acima de um micromolar relataram efeitos pró-oxidantes, enquanto outros sistemas da mesma época relataram proteção contra morte celular induzida por peróxido. Ambas as observações podem ser verdadeiras para o mesmo corante em contextos redox diferentes, e o resultado de DCF, por si só, não permite determinar qual oxidante transportou o sinal. A importância do trabalho anterior com mitocôndrias cerebrais está no facto de ter substituído este rastreio por uma medição calibrada de peróxido e medido diretamente a carga: mesmo cem nanomolar de corante aumentaram várias vezes a libertação de peróxido em todos os substratos e estados respiratórios testados.

O DCFDA apresenta ainda outra armadilha específica do azul de metileno. O corante tem uma coloração intensa e é redox-ativo, pelo que pode provocar fotobranqueamento da fluorescência, extinguir a emissão ou oxidar a química da sonda independentemente das ROS celulares. Um controlo sem células, contendo corante e sonda, não é um elemento decorativo opcional. É a experiência que indica se o corante interage com a sonda.

Captura de spin e consumo de oxigénio: identidade e fluxo

Enquanto as sondas fluorescentes indicam que apareceu algo oxidável, a ressonância de spin eletrónico com agentes de captura de spin fornece informação mais próxima da identidade dessa espécie. O estudo clássico da fotoquímica do azul de metileno utilizou ESR para detetar o radical ascorbato produzido a partir de corante, ascorbato e luz, demonstrando depois a formação de peróxido em experiências de consumo de oxigénio e a formação de radical hidroxilo catalisada por ferro em ensaios de captura de spin. Cada técnica respondeu à pergunta a que as outras não conseguiam responder: a ESR forneceu a identidade dos radicais, o consumo de oxigénio forneceu o fluxo da reação independentemente de qualquer sonda fluorescente, e a combinação mostrou que as vias de oxigénio singuleto e de radicais funcionavam no mesmo sistema iluminado.

Esse resultado de 1984 continua a servir de aviso. Com iluminação e um agente redutor presentes, o corante gerou peróxido e, na presença de ferro, o sistema produziu radical hidroxilo, a espécie mais reativa do conjunto. Os autores relacionaram este fenómeno com o ascorbato presente no olho e questionaram a utilização oftálmica indiscriminada. Os leitores atuais devem ter em conta as condições: luz mais redutor mais ferro. A remoção de qualquer um destes elementos enfraquece ou elimina a via.

Os elétrodos de oxigénio justificam a sua utilização de outra forma. Um elétrodo do tipo Clark mede o consumo líquido de oxigénio, demonstrando que a química redox impulsionada pelo corante está a consumir oxigénio molecular e fornecendo uma cinética que nenhum artefacto de fluorescência consegue imitar. Não identifica o produto. Peróxido, superóxido, água e decomposição de oxigénio singuleto consomem todos oxigénio. Fluxo sem identidade é tão incompleto como identidade sem fluxo, razão pela qual os trabalhos mais robustos associam o elétrodo a um ensaio calibrado de peróxido ou a um agente de captura.

Porque entram em conflito os resultados sobre a ação antioxidante

Quando se colocam lado a lado as três leituras, as aparentes contradições na literatura sobre o azul de metileno resolvem-se em diferenças metodológicas acrescidas de três factos biológicos.

Primeiro, o corante é simultaneamente um transportador de eletrões e uma fonte de peróxido. Ao desviar eletrões dos locais da cadeia respiratória onde, de outro modo, o oxigénio se transformaria em superóxido, pode reduzir uma ROS enquanto a sua forma reduzida reduz diretamente o oxigénio a peróxido, aumentando outra. Um laboratório que estude a química redox mitocondrial e o seu papel como via alternativa deve, portanto, esperar respostas dependentes da sonda: uma leitura sensível ao superóxido diminui enquanto uma leitura de peróxido aumenta na mesma cuvete.

Segundo, o peróxido em doses baixas funciona como sinal, não apenas como agente de dano. O estudo em mitocôndrias cerebrais de ratinho que deu continuidade ao trabalho anterior observou geração de peróxido a partir de apenas cinquenta nanomolar de corante sem lesões no DNA mitocondrial a níveis terapêuticos, com proteção contra lesões induzidas por rotenona após pré-tratamento. Apenas a cem micromolar, muito acima do intervalo terapêutico, o corante danificou fragmentos de DNA selecionados, e luz vermelha combinada com vinte micromolar de corante produziu oxigénio singuleto que danificou todos os fragmentos testados. O mecanismo proposto é hormético: uma produção ligeira de peróxido ativa defesas antioxidantes associadas ao Nrf2 e a biogénese mitocondrial, pelo que uma leitura pró-oxidante a curto prazo precede um resultado antioxidante a mais longo prazo. Um ensaio lido ao fim de uma hora e outro lido ao fim de um dia podem divergir porque a biologia se alterou entretanto.

Terceiro, a luz determina até que molécula está presente. A iluminação desmetila o corante em direção a Azure B e produtos relacionados, e a lâmpada de um microscópio sobre uma placa é suficiente para o fotossensibilizar. Experiências no escuro e experiências iluminadas são experiências diferentes, e a secção de controlos de iluminação e manuseamento do corante de qualquer protocolo deve tratá-las como tal.

Um conjunto mínimo de controlos e como interpretar qualquer afirmação

A comparação abaixo é o recurso de referência original deste artigo. Antes de aceitar qualquer resultado de ROS com azul de metileno, verifique que linhas os autores preencheram e quais omitiram.

Daqui resulta uma regra prática de interpretação. Amplex com peroxidase, calibrado e com verificação por catalase, fornece evidência sobre peróxido. DCFDA fornece evidência sobre oxidação inespecífica da sonda e nada mais. A captura de spin com controlos de sequestradores fornece evidência sobre a identidade dos radicais. O consumo de oxigénio fornece evidência sobre o fluxo. Uma frase que afirme mais do que o respetivo ensaio consegue sustentar, por mais confiante que seja a redação, é uma frase sobre a sonda, não sobre o corante. Discussões relacionadas sobre dependência da dose e o intervalo hormético, fluxo eletrónico mitocondrial, interferência de ensaios em amostras coradas e artefactos de iluminação em microscopia desenvolvem cada um destes pontos, e cada um continua válido quando a respetiva referência provisória for substituída.