Explicação das colorações de azul de metileno alcalino de Loeffler e policromático

Três frascos podem estar lado a lado numa bancada de coloração, cada um rotulado com uma variante de azul de metileno. Um diz azul de metileno aquoso 1%. Outro diz azul de metileno alcalino de Loeffler. Outro diz azul de metileno policromático. Um profissional ocupado pega no que estiver mais perto. O esfregaço fica então demasiado ténue, ou demasiado uniformemente azul, ou com tonalidades inesperadas de roxo, e o resultado acaba por ser atribuído à amostra.

Este é um problema de formulação, não um problema da amostra. As três soluções contêm corantes relacionados, mas representam conceitos de coloração diferentes. Uma é um corante catiónico simples com pH próximo do neutro. Outra é o mesmo corante tornado mais agressivo por um álcali. A terceira já nem sequer é um único corante, mas uma mistura deliberadamente oxidada. Se utilizar a solução errada, o próprio princípio de coloração muda durante o procedimento.

A resposta curta

O azul de metileno aquoso simples é a referência: cerca de 1% de corante em água, uma coloração catiónica simples para morfologia bacteriana e microscopia geral. O azul de metileno alcalino de Loeffler adiciona uma pequena quantidade medida de álcali diluído a uma solução-mãe alcoólica diluída em água, o que aumenta o pH e intensifica a ligação do corante catiónico às estruturas bacterianas ácidas. O azul de metileno policromático é azul de metileno deliberadamente maturado por oxidação em meio alcalino, pelo que o frasco contém uma mistura de homólogos desmetilados (azure A, azure B, azure C), tionina e violeta de metileno, juntamente com azul de metileno residual, e essa mistura cora estruturas diferentes com tonalidades diferentes.

Se memorizar apenas uma frase: a alcalinização altera a intensidade da coloração, enquanto a policromatização altera as cores da coloração.

Azul de metileno aquoso comum: o ponto de referência

A formulação mais simples é azul de metileno dissolvido em água, normalmente a 1% w/v, sem álcali e sem oxidação. A espécie colorida é o catião metiltionínio com um contra-ião cloreto, um pequeno corante plano de fenotiazina descrito no registo de azul de metileno do PubChem como cloreto de metiltionínio. Enquanto catião, liga-se aos esqueletos fosfato dos ácidos nucleicos e aos grupos ácidos das paredes celulares bacterianas, corando as células de azul sobre um fundo claro.

A sua vantagem é a previsibilidade. Os núcleos e as bactérias aparecem azuis. O contraste é moderado. Os organismos pouco evidentes podem corar fracamente, precisamente a limitação que Loeffler procurou resolver. Para uma visão geral da família mais ampla de colorações bacterianas simples a que esta solução pertence, consulte uma descrição geral da coloração bacteriana simples. A disciplina na identificação continua a ser importante: o azul de metilo é uma molécula completamente diferente, como explica azul de metilo versus azul de metileno, pelo que uma pesquisa em catálogo baseada apenas no nome da cor pode levar à classe de corante errada.

Azul de metileno alcalino de Loeffler: o mesmo corante, levado mais longe

A receita clássica de Loeffler combina uma solução-mãe alcoólica de azul de metileno com álcali diluído em água. As versões de manual indicam 0.3 g de corante em 30 mL de etanol a 95% mais 100 mL de hidróxido de potássio aquoso a 0.01% (ou, de forma equivalente, 30 mL de azul de metileno alcoólico saturado, 100 mL de água destilada e 1 mL de KOH a 1%), produzindo uma solução de trabalho com cerca de 0.3% de corante e um pH nitidamente alcalino. As versões comerciais seguem o mesmo princípio, e o catálogo de corantes para microbiologia da Thermo Fisher apresenta o azul de metileno alcalino de Loeffler juntamente com as variantes policromática e aquosa como artigos de catálogo distintos, com utilizações previstas distintas.

O álcali é o elemento essencial. O aumento do pH desprotona os grupos carboxilo e fosfato da amostra, aumentando a densidade de locais negativos, enquanto a solução-mãe em etanol mantém o corante completamente dissolvido para que chegue a esses locais na forma monomérica. O resultado é uma coloração bacteriana mais rápida e intensa do que a obtida com o corante aquoso neutro, com os conhecidos bacilos e cocos azul-escuros de um esfregaço bacteriológico de rotina. O tempo de coloração é normalmente de um a três minutos, seguido de enxaguamento com água.

A aplicação clássica é Corynebacterium diphtheriae cultivado em meio de soro de Loeffler: bacilos delgados, frequentemente claviformes, com grânulos metacromáticos de Babes-Ernst de polifosfato armazenado fortemente corados. A associação entre o meio e a coloração é histórica, sendo ambos atribuídos ao mesmo bacteriologista, e o contraste dos grânulos é o principal benefício diagnóstico. Para além do trabalho relacionado com difteria, a coloração é utilizada como coloração bacteriológica geral de esfregaços de culturas, para observar a morfologia de Neisseria em esfregaços clínicos e sempre que uma coloração de Gram seja desnecessária, mas o azul aquoso simples produza uma coloração demasiado ténue. É uma coloração monocromática. Tudo o que é ácido adquire alguma tonalidade de azul. Quando um protocolo exige diferenciação por cor, o álcali por si só não a consegue fornecer.

Uma precaução prática: as soluções alcalinas de corante deterioram-se e formam precipitados durante o armazenamento e com a absorção de dióxido de carbono. Os laboratórios preparam volumes moderados ou compram a solução de catálogo e respeitam o seu prazo de validade, em vez de prolongarem a utilização de um frasco antigo que já deposita sedimento em todas as lâminas.

Azul de metileno policromático: um nome, vários corantes

O azul de metileno policromático parte do mesmo corante, mas é submetido a oxidação controlada em meio alcalino, historicamente designada maturação ou policromatização. O envelhecimento alcalino, o aquecimento com carbonato ou a oxidação com agentes como o dicromato removem progressivamente grupos metilo dos substituintes dimetilamino. O produto é uma mistura: azul de metileno residual mais azure B (perda de um grupo metilo), azure A e azure C (desmetilação adicional), tionina (totalmente desmetilada) e produtos secundários oxidativos da família do violeta de metileno. Cada componente possui a sua própria tonalidade e afinidade pelos tecidos, pelo que a mistura produz coloração metacromática: núcleos, grânulos, mucinas e cartilagem adquirem tonalidades distintas entre azul e vermelho-púrpura.

Esta química é a mesma que está na origem das famosas colorações sanguíneas. Os primeiros investigadores verificaram que o azul de metileno alcalinizado corava os núcleos dos parasitas da malária em tonalidades de roxo, mas as suas soluções aquosas maturadas eram instáveis e precipitavam ao fim de poucos dias. A análise de como foi inventada a coloração púrpura do sangue descreve como Malachowski e Romanowsky exploraram independentemente este efeito em 1891, como o metanol foi introduzido para estabilizar o precipitado de corante e fixar os esfregaços sem calor e como Giemsa posteriormente normalizou a mistura com quantidades medidas de azure B e eosina, estabilizadas com glicerol. As colorações modernas do tipo Giemsa descendem diretamente do azul de metileno policromático mais eosina, a combinação que produz o efeito de Romanowsky. Para detalhes sobre a combinação com eosina e o componente azure B, consulte colorações do tipo Romanowsky e a interação entre azure B e eosina.

Por ser uma mistura, o azul de metileno policromático é, por natureza, o menos normalizado dos três. O equilíbrio exato das tonalidades depende da via e do grau de oxidação, motivo pelo qual os fornecedores de histologia o comercializam como um produto distinto, sujeito aos seus próprios ensaios de desempenho, e não simplesmente como azul de Loeffler envelhecido. As utilizações típicas incluem a demonstração metacromática de grânulos de mastócitos, mucinas e cartilagem, o detalhe de plasmócitos e Helicobacter pylori em cortes de tecido através de métodos policromáticos do tipo Goodpasture. É a escolha adequada quando a questão é a diferenciação por cor e a escolha errada quando o protocolo exige uma silhueta bacteriana monocromática nítida.

Comparação entre formulação e finalidade

Leia a tabela como um procedimento de decisão. Se a amostra ficar demasiado ténue, altere o conceito de pH e escolha Loeffler. Se tudo ficar corado, mas nada se distinguir, altere o conceito de corante e escolha o policromático. Se um esfregaço de Loeffler mostrar os grânulos claramente, mas o supervisor perguntar por que razão os núcleos e o citoplasma apresentam o mesmo azul, a resposta é que nenhuma coloração monocromática alcalina consegue desempenhar essa função. Essa questão pertence à família policromática e aos seus derivados para coloração do sangue.

Evitar as confusões habituais

Dois erros explicam a maior parte da confusão. O primeiro é tratar o azul de Loeffler como intercambiável com o azul de metileno simples porque ambos parecem azuis no frasco. Diferem em pH e intensidade, e substituir o corante neutro quando o protocolo especifica Loeffler elimina precisamente o contraste dos grânulos para o qual o protocolo foi concebido. O segundo é considerar como policromático qualquer azul alcalino antigo ou envelhecido acidentalmente. O envelhecimento não controlado produz uma mistura desconhecida com concentração desconhecida, enquanto as verdadeiras soluções policromáticas são preparadas através de vias de oxidação definidas e, na linhagem das colorações sanguíneas, combinadas com quantidades medidas de eosina. A história é elucidativa: as soluções aquosas maturadas e instáveis da década de 1890 deram lugar a formulações metanólicas estabilizadas precisamente porque as misturas não controladas não podiam ser reproduzidas, uma lição que vale a pena recordar antes de corar uma lâmina diagnóstica com um frasco de idade incerta.

A disciplina na nomenclatura completa o processo. Confirme no rótulo o artigo de catálogo (aquoso vs Loeffler vs policromático), o teor de corante e a aplicação prevista, em vez de os inferir pela cor. As três formulações partilham um cromóforo ancestral. Não partilham a mesma finalidade. :::