Coloração de células da bochecha com azul de metileno: o que observar

Uma aluna coloca uma gota de suspensão de células da bochecha numa lâmina, observa ao microscópio e quase não vê nada. Algumas formas pálidas e fantasmagóricas atravessam o campo claro. Ajusta a focagem, depois aumenta a iluminação e, por fim, conclui que a lâmina está vazia. A lâmina não está vazia. As células estão lá. São quase transparentes, e a transparência é precisamente o problema que esta coloração existe para resolver.

Vale a pena identificar esta diferença entre expectativa e imagem antes de iniciar o protocolo. Os principiantes esperam que um microscópio revele detalhes da mesma forma que o zoom de uma câmara revela uma placa distante. Um microscópio de campo claro faz algo mais específico: mostra diferenças na absorção da luz. Uma célula da bochecha não corada quase não absorve luz, pelo que praticamente não cria contraste. O azul de metileno acrescenta essa diferença. Liga-se no interior da célula de forma desigual e transforma a estrutura em contraste. Quando os alunos compreendem este conceito, cada passo seguinte passa a ser entendido como uma consequência, e não apenas como uma receita.

É útil compreender como as colorações simples aumentam o contraste no laboratório escolar, e uma revisão de como preparar um microscópio de campo claro antes da coloração evita metade das lâminas mal preparadas. A química responsável pela cor é explicada numa introdução ao azul de metileno em microscopia, que aborda por que razão este corante aparece com tanta frequência na bancada.

O protocolo para sala de aula

A versão com preparação húmida abaixo é a opção padrão mais simples para aulas gerais. Não requer chama nem uma etapa de fixação. A variante com esfregaço fixado utilizada em alguns manuais universitários acrescenta secagem ao ar e uma breve fixação pelo calor, como na atividade de esfregaço da bochecha do North Central Texas College publicada através do Biology LibreTexts, mas a fixação pelo calor é uma prática da microbiologia, não um requisito para observar células epiteliais.

Material necessário: lâminas e lamelas limpas, zaragatoas estéreis de utilização única (preferencialmente) ou palitos planos novos, um frasco conta-gotas com azul de metileno aquoso a 0.5 a 1 percent, água destilada ou desionizada, papel absorvente, luvas e um microscópio composto com ampliação total de 100x e 400x.

1. Enxaguar a boca com água simples. Isto remove partículas de alimentos que, mais tarde, podem corar intensamente e desviar a atenção das células.
2. Cada aluno recolhe uma amostra apenas da própria bochecha. Esfregar suavemente o interior da bochecha com uma zaragatoa estéril nova. Pressionar, não raspar. Parar muito antes de causar desconforto ou sangramento.
3. Fazer rolar a zaragatoa numa camada fina pelo centro de uma lâmina limpa. Uma película fina é o fator que mais contribui para obter uma lâmina legível. Um depósito branco espesso ficará corado numa massa azul impossível de interpretar.
4. Adicionar uma gota de azul de metileno sobre o esfregaço. Deixar atuar durante 1 a 3 minutos. Um minuto é suficiente em muitos protocolos universitários; o manual de laboratório de ciências da Classe IX do NCERT utiliza cerca de 3 minutos para uma preparação temporária. Mais tempo não é melhor, e o excesso de coloração é o erro de temporização mais comum.
5. Enxaguar suavemente com água destilada ou remover o excesso de corante com papel absorvente, conforme o protocolo local. O fundo deve ficar azul-claro, não azul-marinho escuro.
6. Baixar a lamela em ângulo, deixando primeiro uma das extremidades tocar na lâmina, e depois deixá-la descer lentamente. Isto ajuda a evitar bolhas de ar.
7. Começar com baixa ampliação para localizar as células, confirmar a focagem e a centralização, depois avançar para 100x e, por fim, 400x. A 400x, utilizar apenas o parafuso micrométrico.

A concentração do corante merece uma indicação precisa. Os protocolos escolares tendem a utilizar azul de metileno aquoso a cerca de 1 percent. Uma solução-mãe mais concentrada ou uma exposição prolongada escurece o fundo mais rapidamente do que escurece o núcleo, invertendo o contraste de que este exercício depende.

Manuseamento seguro do material da bochecha

As amostras da bochecha contêm saliva e microrganismos orais normais, pelo que cada esfregaço fresco deve ser tratado como material potencialmente infecioso, mesmo quando os dadores são colegas saudáveis. As orientações de biossegurança da American Society for Microbiology para laboratórios de ensino estabelecem os princípios gerais: avaliar o risco antes da sessão, usar luvas, proteger os olhos quando houver possibilidade de salpicos, lavar as mãos no final, desinfetar as bancadas e eliminar os materiais descartáveis contaminados através do circuito aprovado para resíduos biológicos.

Quatro regras de sala de aula cobrem a maior parte do risco. Uma zaragatoa e uma lâmina por dador, nunca partilhadas. Apenas autorrecolha, nunca recolher amostras de um colega. As zaragatoas e os palitos de utilização única vão diretamente para o recipiente de resíduos designado, nunca de volta para a bancada. O próprio azul de metileno mancha a pele e a roupa e irrita os olhos, pelo que se aplicam luvas e as práticas normais de manuseamento de corantes. Não prolongar este exercício para o cultivo de qualquer material do esfregaço e não improvisar a fixação pelo calor de material humano fresco fora do procedimento de segurança da escola.

O que observar e por que razão tem esse aspeto

A 100x, procurar células largas e planas, azul-pálidas, com contornos ovais ou poligonais irregulares. Podem aparecer isoladas ou em camadas frouxas e sobrepostas. Cada célula apresenta normalmente um ponto azul mais escuro. Esse ponto é o núcleo. Observar também a disposição: as células epiteliais pavimentosas são placas finas, não esferas, razão pela qual as suas margens se assemelham mais a esmalte rachado do que a balões redondos.

A 400x, três características tornam-se claramente visíveis. O limite celular aparece como uma linha fina e mais escura que delimita a célula. O citoplasma preenche o interior com um azul-claro uniforme. O núcleo surge mais escuro e compacto, muitas vezes oval, geralmente próximo do centro, mas nem sempre. Pedir aos alunos que registem estas três características, juntamente com a forma e a ampliação, porque é exatamente isso que a ficha de trabalho solicita.

Há aqui um ponto de rigor importante que muitas fichas de trabalho apresentam de forma incorreta. O limite visível corresponde à região da membrana plasmática, mas a própria membrana, uma bicamada lipídica com aproximadamente 7 a 10 nanometers de espessura, está muito abaixo da capacidade de resolução de um microscópio escolar. O que os alunos veem é o limite ótico da célula, juntamente com o corante acumulado nessa região. O mesmo cuidado se aplica aos organelos. Mitocôndrias, retículo endoplasmático, aparelhos de Golgi e ribossomas não aparecem nesta preparação. Um microscópio ótico convencional consegue resolver estruturas até cerca de 0.2 micrometers em boas condições, como explica o material de referência do NCBI sobre ferramentas de microscopia em biologia celular, e a maior parte da ultraestrutura encontra-se abaixo ou perto desse limite. Uma ampliação superior sem resolução adicional apenas torna a imagem maior, sem acrescentar detalhe.

Por que razão o núcleo fica mais escuro? O azul de metileno é um corante catiónico, com carga positiva em solução, e associa-se a materiais com carga negativa no interior da célula, sobretudo aos ácidos nucleicos. A cromatina concentra o DNA no núcleo, pelo que o núcleo acumula a maior quantidade de corante. O citoplasma contém RNA e outras moléculas carregadas, pelo que também fica corado, mas de forma mais difusa e mais clara. A ressalva essencial é esta: o azul de metileno não é um corante específico para DNA. Trabalhos sobre a distribuição do azul de metileno em imagiologia nuclear descrevem a associação do catião a regiões ricas em ácidos nucleicos, e estudos quantitativos anteriores sobre a ligação do azul de metileno em preparações celulares concluíram que a maior parte do corante ligado estava associada a ácidos nucleicos. Assim, um núcleo escuro e um citoplasma claro constituem um padrão de contraste, não um ensaio molecular.

Erros que os alunos irão cometer e como interpretá-los

Quase todas as lâminas mal preparadas se enquadram num de cinco padrões. Ensine os alunos a diagnosticar a lâmina em vez de repetirem o procedimento às cegas.

O excesso de coloração torna as células e o fundo uniformemente escuros, fazendo com que o núcleo desapareça no campo. Corrigir reduzindo o tempo de coloração ou realizando um enxaguamento mais completo. Uma coloração insuficiente deixa formas fantasmagóricas que desaparecem quando a intensidade da luz aumenta; aumentar o tempo em intervalos de thirty second. Esfregaços espessos produzem massas densas e sobrepostas nas quais não é possível distinguir qualquer contorno; a correção é mecânica: espalhar uma camada mais fina da próxima vez, uma vez que nenhum enxaguamento consegue recuperar uma acumulação de células. As bolhas de ar aparecem como círculos perfeitos com margens escuras e nítidas e confundem os principiantes, que podem tomá-las por estruturas; baixar a lamela lentamente em ângulo. Pequenos pontos escuros dispersos sobre ou em redor das células são normalmente bactérias orais habituais, como referem protocolos escolares como o procedimento para células da bochecha da Ingrid Science. Confirmam que a boca é habitada por microrganismos, algo de que os alunos poderão recordar-se, mas não permitem identificar espécies neste exercício e não devem ser desenhados como partes da célula. Resíduos alimentares e filamentos de muco coram de forma irregular e intensa; o enxaguamento prévio serve para os reduzir.

O que este exercício não permite fazer

Esta é uma observação educativa, não um teste de diagnóstico. O aspeto das células numa coloração realizada em sala de aula não permite diagnosticar infeções, cancro ou qualquer doença, e este artigo não deve ser interpretado como sugerindo o contrário. A preparação mostra a forma, o limite, o citoplasma e o núcleo em duas ampliações. Não mostra a ultraestrutura da membrana, detalhes dos organelos nem identidade molecular. Declarar explicitamente estas limitações protege tanto o rigor científico como os alunos: um bom resultado é um desenho corretamente legendado, com a ampliação e o corante registados, não uma conclusão sobre o estado de saúde.

Ficha de trabalho para alunos e micrografias legendadas

Os dois recursos do projeto para esta página são a micrografia legendada acima e a ficha de trabalho abaixo. Imprima uma ficha por aluno ou projete-a e peça aos alunos que copiem os quadros para os cadernos.

Como utilizá-la numa sessão de 45 minute: ten minutes para instruções de segurança e recolha da amostra, ten minutes para coloração e montagem, fifteen minutes para observação e desenho em ambas as ampliações, ten minutes para a lista de verificação e comparação com a micrografia legendada. Os itens da lista de verificação são deliberadamente mecânicos. Esfregaço fino, tempo de coloração correto, núcleo mais escuro do que o citoplasma, ampliação registada. Um aluno que consiga assinalar os quatro itens compreendeu o conceito que esta aula pretende ensinar: os microscópios mostram diferenças, e os corantes criam as diferenças que vale a pena tornar visíveis. :::