Rozpuszczalność błękitu metylenowego i przygotowanie roztworów: przewodnik laboratoryjny

Dwóch techników przygotowuje z proszku roztwór błękitu metylenowego o stężeniu 1 procent. Jeden odważa 1.00 gram i dopełnia kolbę do 100 mL. Drugi odważa 1.00 gram, dodaje go do 100 mL wody i uznaje przygotowanie za zakończone. Trzeci technik odważa 1.00 gram z innej partii i uzyskuje mierzalnie inne stężenie. Wszystkie trzy butelki mają identyczne etykiety. Żadna nie zawiera dokładnie tego, co podano na etykiecie, a różnice wynikają z trzech łatwych do pomylenia kwestii: ile substancji może rozpuścić rozpuszczalnik, czym faktycznie jest odważony proszek i do czego odnosi się procent.

Ten przewodnik dotyczy wyłącznie przygotowywania roztworów laboratoryjnych: barwników do wybarwiania, wskaźników, analitycznych roztworów macierzystych i rozcieńczeń roboczych. Nie jest recepturą leku doustnego ani do wstrzykiwań, a podanych tu stężeń nie należy traktować jako dawek.

Co określa rozpuszczalność, a czego nie

Rozpuszczalność błękitu metylenowego w wodzie jest wysoka jak na barwnik. Karta błękitu metylenowego w bazie PubChem podaje około 43.6 grama na litr w temperaturze 25 C, co odpowiada 4.36 grama na 100 mL, czyli 4.36 procent w/v. W niezależnym badaniu równowagowym w tej samej temperaturze zmierzono 43.21 g/L i potwierdzono wcześniejszą wartość w granicach błędu doświadczalnego.

Ta liczba jest górną granicą, a nie celem. Roztwór macierzysty o stężeniu 1 procent to 10 g/L, mniej niż jedna czwarta tej granicy. Roztwór macierzysty o stężeniu 0.1 procent to 1 g/L, czyli mniej więcej jedna czterdziesta tej wartości. Jeśli po prawidłowym mieszaniu w temperaturze pokojowej w roztworze o stężeniu 1 procent nadal pozostają nierozpuszczone cząstki, problemem niemal nigdy nie jest granica rozpuszczalności. Zwykle przyczyną jest niepełne zwilżenie, zimna woda, grudki proszku wymagające więcej czasu lub błędnie zidentyfikowana substancja rozpuszczana. Ciepła woda i mieszanie rozwiązują większość tych problemów. Jeśli zastosowano ogrzewanie, przed dopełnieniem do objętości końcowej należy poczekać, aż kolba wróci do temperatury, w której została wzorcowana.

Rozpuszczalność w innych rozpuszczalnikach jest niższa, a wartości w źródłach są mniej zgodne, częściowo z powodu różnic w stopniu uwodnienia badanego materiału. Woda pozostaje rozpuszczalnikiem odniesienia dla rutynowych laboratoryjnych roztworów macierzystych. Etanol rozpuszcza barwnik, lecz mieści go znacznie mniej niż woda; chloroform również go rozpuszcza, pirydyna tylko w niewielkim stopniu, a eter dietylowy praktycznie wcale. W seriach pomiarowych aceton i octan etylu wykazują znacznie niższą rozpuszczalność niż woda. W pracach z rozpuszczalnikami niewodnymi każdą wartość z podręcznika należy traktować jako wstępne oszacowanie i zweryfikować dla konkretnej partii, zamiast uznawać ją za granicę przy przygotowywaniu roztworu. Wniosek praktyczny jest prosty: jeśli celem jest określone stężenie w roztworze wodnym wynoszące najwyżej 1 procent, woda zapewnia duży zapas rozpuszczalności.

Proszek nie jest jedną, niezmienną substancją

Błękit metylenowy w proszku sprzedawany do zastosowań laboratoryjnych jest solą chlorkową zawierającą wodę w sieci krystalicznej, a ilość tej wody jest zmienna. Bezwodny jon ma masę molową 319.85 g/mol. Często podawany trihydrat ma masę molową 373.90 g/mol, a pentahydrat 409.93 g/mol; wartości te zestawiono w danych z monografii USP podsumowanych przy karcie PubChem.

Butelki handlowe są często oznaczane jako trihydrat, CAS 7220-79-3, lecz badania stanu stałego wykazały, że rzeczywisty materiał może być pentahydratem, częściowym hydratem zawierającym około 2.2 cząsteczki wody, dihydratem lub monohydratem; w niektórych analizach nie stwierdzono odrębnej krystalicznej fazy trihydratu. Barwnik jest też higroskopijny, więc zawartość wody w otwartej butelce zmienia się z czasem. Przy wybarwianiu jakościowym ma to niewielkie znaczenie. W ilościowych pracach analitycznych znaczenie jest bardzo duże, dlatego wskazówki dotyczące odczytywania zawartości oznaczanej substancji i wody w certyfikacie analizy uznają dokumentację partii za bardziej miarodajną niż słowo „trihydrat” na przedniej etykiecie.

Wynikają z tego dwie metody korekty, z których należy stosować tylko jedną naraz. Jeśli certyfikat podaje zawartość oznaczanej substancji oraz zawartość wody lub stratę przy suszeniu, należy bezpośrednio wykorzystać te wartości. Jeśli dane z certyfikatu nie są dostępne, a stężenie musi być wyrażone w przeliczeniu na postać bezwodną, należy zastosować teoretyczny współczynnik dla hydratu: 373.90 podzielone przez 319.85, czyli 1.169, dla nominalnego trihydratu, oraz 409.93 podzielone przez 319.85, czyli 1.282, dla nominalnego pentahydratu. Nie należy stosować obu korekt jednocześnie. Prowadzi to do dwukrotnego uwzględnienia wody.

Co oznacza procent

Procent w/v oznacza gramy określonej substancji rozpuszczonej na 100 mL końcowego roztworu, a nie na 100 mL wody użytej na początku. Zatem 1 procent w/v to 1.000 g na 100 mL objętości końcowej, co odpowiada 10 mg/mL lub 10 g/L. Roztwór o stężeniu 0.1 procent to 0.100 g na 100 mL objętości końcowej, czyli 1 mg/mL. Częste mylenie 1 procent z 1 mg/mL jest błędem dziesięciokrotnym i warto sprawdzać każdą etykietę pod tym kątem.

Drugą częścią definicji jest określenie substancji rozpuszczonej. Roztwór o stężeniu 1 procent odnoszącym się do odważonego proszku trihydratu i roztwór o stężeniu 1 procent wyrażonym w przeliczeniu na postać bezwodną to różne roztwory. Poniższe przykłady za każdym razem podają zarówno objętość końcową, jak i podstawę wyrażenia stężenia. Ten nawyk pozwala uniknąć opisanego wyżej problemu trzech techników.

Przykłady przygotowania z podanymi założeniami dotyczącymi hydratu

Wszystkie przykłady zakładają użycie czystego proszku wskazanego hydratu i wody jako rozpuszczalnika w temperaturze pokojowej. Dla innych objętości należy przeliczać ilości proporcjonalnie.

Przykład A: 100.0 mL roztworu o stężeniu 1 procent w/v, w odniesieniu do odważonego trihydratu. Odważyć 1.000 g trihydratu błękitu metylenowego. Dodać około 70 mL wody oczyszczonej, mieszać mieszadłem lub ruchem okrężnym naczynia do całkowitego rozpuszczenia, przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 100.0 mL wraz z popłuczynami, a następnie dopełnić wodą do kreski. Substancją rozpuszczoną jest sam trihydrat, więc nie stosuje się korekty na masę molową. Wynik: 1.000 g na 100.0 mL objętości końcowej, czyli 10 mg/mL w odniesieniu do odważonego proszku.

Przykład B: 100.0 mL roztworu o stężeniu 1 mg/mL, w przeliczeniu na postać bezwodną, z nominalnego trihydratu. Celem jest 100.0 mg bezwodnego błękitu metylenowego w 100.0 mL objętości końcowej. Pomnożyć przez 1.169, aby uwzględnić trzy cząsteczki wody: 100.0 mg razy 1.169 daje 116.9 mg. Odważyć 116.9 mg nominalnego trihydratu, rozpuścić w około 70 mL wody i dopełnić do objętości końcowej 100.0 mL w kolbie miarowej. Dla nominalnego pentahydratu współczynnik wynosi 1.282, więc ten sam cel wymaga 128.2 mg. Na etykiecie zapisać, którego współczynnika użyto.

Przykład C: rozcieńczenie błękitu metylenowego z roztworu macierzystego o stężeniu 1 procent do 0.1 procent. Zastosować C1V1 równa się C2V2. Aby przygotować 100.0 mL roztworu o stężeniu 0.1 procent z roztworu macierzystego o stężeniu 1.0 procent, wymagana objętość roztworu macierzystego wynosi 0.1 razy 100.0 podzielone przez 1.0, czyli 10.0 mL. Odmierzyć pipetą 10.0 mL roztworu macierzystego o stężeniu 1 procent do kolby o pojemności 100.0 mL i dopełnić wodą do kreski. Dla analityków preferujących jednostki masy: 1 procent to 10 mg/mL, więc 10.0 mL zawiera 100 mg, a 100 mg w 100.0 mL objętości końcowej daje 1 mg/mL, czyli 0.1 procent.

Przykład D: 1.000 L roztworu roboczego o stężeniu 10 mg/L z roztworu macierzystego o stężeniu 1 mg/mL. Roztwór macierzysty o stężeniu 1 mg/mL to 1000 mg/L. Wymagana objętość wynosi 10 razy 1.000 podzielone przez 1000, czyli 0.0100 L lub 10.0 mL. Odmierzyć pipetą 10.0 mL roztworu macierzystego i rozcieńczyć wodą do objętości końcowej 1.000 L. Z roztworu macierzystego o stężeniu 1 procent, czyli 10,000 mg/L, ten sam cel wymaga tylko 1.00 mL dopełnionego do 1.000 L. Dwustopniowe rozcieńczenie seryjne zapewnia lepszą dokładność niż pojedyncze przeniesienie objętości mikrolitrowej, gdy stosunek rozcieńczenia przekracza około sto.

Każdy z tych opisów jest kompletny tylko dlatego, że zawiera trzy informacje: odważoną masę wraz z założeniem dotyczącym hydratu, końcową objętość roztworu i podstawę wyrażenia podanego stężenia. Zapisu w dzienniku laboratoryjnym, w którym brakuje choć jednej z tych informacji, nie można dokładnie odtworzyć.

Procedura pozwalająca uniknąć typowych błędów

Najpierw należy rozpuścić proszek w objętości mniejszej niż końcowa, a następnie dopełnić do wymaganej objętości. Dodanie proszku bezpośrednio do pełnej końcowej objętości wody daje roztwór, którego całkowita objętość przekracza zamierzoną kreskę, przez co stężenie jest zbyt niskie. Popłuczyny ze zlewki należy przenieść do kolby, aby nie pozostawić w zlewce barwnika; intensywna barwa uwidacznia niewielkie straty, co jest zaletą, jeśli skłania do ilościowego przeniesienia.

Przed dopełnieniem do objętości należy mieszać do zniknięcia wszystkich cząstek i obejrzeć roztwór pod światło. Filtrować tylko wtedy, gdy wymaga tego metoda. Błękit metylenowy adsorbuje się na niektórych materiałach membranowych, więc filtracja może obniżyć stężenie roztworu macierzystego, którego stężenie właśnie ustalono. Zjawisko to udokumentowano w badaniach adsorpcji na membranach i warto o nim pamiętać zawsze, gdy filtracja lub weryfikacja stężenia stanowi część metody. Jeśli przefiltrowany roztwór macierzysty musi mieć potwierdzone stężenie, należy zweryfikować je po filtracji, a nie przed nią.

Przygotowane roztwory należy przechowywać w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed silnym światłem, w butelkach z bursztynowego szkła lub nieprzezroczystych, i oznaczać etykietą podającą substancję rozpuszczoną, podstawę dotyczącą hydratu, stężenie, rozpuszczalnik, datę oraz osobę przygotowującą. Fotoodbarwianie przy długotrwałym oświetleniu jest znanym mechanizmem degradacji, dlatego parapety i oświetlone lodówki są niewłaściwymi miejscami przechowywania, nawet jeśli barwnik wygląda na stabilny. Oczekiwaną stabilność i odstępy między ponownymi badaniami omawiają wskazówki dotyczące przechowywania i stabilności przygotowanych roztworów, lecz w praktyce analityczne roztwory macierzyste należy przygotowywać na świeżo lub ponownie weryfikować, zamiast bezterminowo ufać ich parametrom.

Podczas pracy z proszkiem i stężonymi roztworami macierzystymi należy używać rękawic, ochrony oczu, fartucha laboratoryjnego i osłony blatu, a butelki umieszczać w dodatkowych pojemnikach zabezpieczających przed rozlaniem. Barwnik szybko plami skórę, odzież, blaty i tworzywa sztuczne, a karty charakterystyki dostawców klasyfikują proszek jako szkodliwy po połknięciu oraz, zależnie od klasy jakości, drażniący dla oczu i skóry. Pełny zestaw środków ostrożności opisują zasady bezpiecznego postępowania i przechowywania, lecz samo zapobieganie zabrudzeniom jest elementem zapewnienia jakości: pozostałości barwnika na szkle laboratoryjnym i pipetach są źródłem zanieczyszczenia krzyżowego w analizie śladowej.

Uwaga dotycząca klasy jakości

Do kąpieli barwiących i pokazów sprawdza się materiał dowolnej czystej klasy laboratoryjnej, przygotowany we właściwym stężeniu. W pracach ilościowych lub porównawczych klasa jakości ma znaczenie, ponieważ różnią się zanieczyszczenia: pozostałości Azure B i pokrewnych tiazyn, metale ciężkie, pozostałości rozpuszczalników oraz obciążenie mikrobiologiczne. Dlatego wybór klasy jakości popartej pełnym certyfikatem analizy jest częścią przygotowania roztworu, a nie kwestią rozważaną dopiero na końcu. Pełna dokumentacja partii podaje tożsamość substancji, oznaczoną zawartość wraz z podstawą jej wyrażenia, zawartość wody i zestaw faktycznie zbadanych zanieczyszczeń, dzięki czemu korekta na hydrat w powyższych przykładach wykorzystuje wartości zmierzone zamiast założenia o nominalnym trihydracie. Gdy dwie partie dają różne stężenia przy tej samej odważonej masie, certyfikat zwykle wyjaśnia przyczynę.