Paul Ehrlich i błękit metylenowy: jak barwnik pomógł ukształtować odkrywanie leków

Wkładem Paula Ehrlicha w medycynę nie był lek. Był nim sposób myślenia o tym, jak badać leki.

W 1878 roku złożył rozprawę doktorską, której pierwsza część nosiła tytuł „Chemiczne ujęcie barwienia”. Dowodził w niej, że barwienie skrawka tkanki i farbowanie kawałka tkaniny opierają się na tej samej logice. W obu przypadkach barwa utrzymuje się dzięki powinowactwu chemicznemu między barwnikiem a materiałem, a nie dlatego, że tkanka jest chłonna, tłusta lub ma kształt pozwalający zatrzymać pigment. Ehrlich dorastał, obserwując swojego kuzyna, patologa Karla Weigerta, przygotowującego barwione skrawki. Jego uwagę przyciągały nie obrazy, lecz to, że barwnik wybierał, dokąd trafić.

To twierdzenie brzmi skromnie. Takie jednak nie jest. Jeśli barwnik wiąże się z tkanką z przyczyn chemicznych, to wzór wybarwienia mówi o chemii tej tkanki. Barwiony preparat przestaje być ilustracją, a staje się pomiarem.

Ehrlich od razu rozwinął tę koncepcję. W 1880 roku połączył błękit metylenowy z fuksyną kwaśną i nazwał mieszaninę barwnikiem obojętnym, neutralen Farbkörper. Pozwalała ona rozróżnić typy białych krwinek tam, gdzie używane wówczas pojedyncze barwniki nie dawały takiej możliwości. Dwa lata później przedstawił metodę barwienia prątków gruźlicy fioletem metylowym, a Koch przyjął tę procedurę we własnych badaniach.

Teoria, która później dała tym praktykom wspólną podstawę, to osobna kwestia, a jej datowanie bywa nagminnie upraszczane. Teoria łańcuchów bocznych Ehrlicha — koncepcja, zgodnie z którą substancja działa na komórkę, ponieważ są one chemicznie kompatybilne — pochodzi z lat 90. XIX wieku, a nie z okresu jego badań nad barwnikami. Wcześniejsze prace dostarczyły przekonania, które ją poprzedzało: selektywność ma charakter chemiczny, można więc jej poszukiwać, zamiast trafiać na nią przypadkiem.

Eksperyment, który zamienił barwnik w mapę

W 1885 roku Ehrlich opublikował monografię o zapotrzebowaniu organizmu na tlen, z podtytułem określającym ją jako badanie oparte na analizie barw. Metoda polegała na wstrzykiwaniu barwników, których kolor zależy od stopnia utlenienia, a następnie porównywaniu, jak różne narządy je redukują lub zachowują w niezmienionej postaci. Barwnik służył jako przyrząd, podobnie jak termometr: informował o warunkach wewnątrz tkanki, których nie dało się zbadać bezpośrednio. Sam Ehrlich określił cel jako ustalenie, za pomocą określonych barwników, zdolności redukcyjnej żywych narządów.

Wynik dotyczący błękitu metylenowego ukazał się w 1886 roku w pracy o reakcji barwnika z żywą tkanką nerwową, przedstawionej towarzystwu lekarskiemu w grudniu poprzedniego roku. Błękit metylenowy wprowadzano do krwiobiegu żywego zwierzęcia, po czym pobierano cienkie skrawki tkanki i wystawiano je na działanie powietrza. Nagromadzony bezbarwny barwnik utleniał się wtedy ponownie do niebieskiej postaci, ujawniając miejsca, w których się zebrał. Komórki i włókna nerwowe przyjmowały barwę na tyle selektywnie, że technika ta stała się standardową metodą uwidaczniania tkanki nerwowej. Związek nie był już tylko substancją barwiącą, nanoszoną na martwy skrawek na stole laboratoryjnym. Stał się znacznikiem, który rozprowadzał się wewnątrz żywego ciała, a jego rozmieszczenie można było odczytać.

Właściwość leżącą u podstaw obu eksperymentów warto nazwać wprost, ponieważ zależy od niej cała dalsza historia. Przemiany błękitu metylenowego są odwracalne. Jego zredukowana postać, leukobłękit metylenowy, jest bezbarwna, a w kontakcie z tlenem powraca do postaci niebieskiego kationu. Roztwór barwnika z glukozą w szczelnie zamkniętym słoiku jest bezbarwny; po otwarciu słoika staje się niebieski. Według opisu Ehrlich pokazał to bezpośrednio, poddając barwione skrawki działaniu chlorku żelaza oraz powietrza i obserwując powrót barwy. Barwnik, który zmienia kolor wraz ze stanem redoks swojego otoczenia, jest sondą pozwalającą badać to otoczenie.

Obok siebie znalazły się więc dwie właściwości. Barwnik mógł odróżniać jedną tkankę od drugiej. Mógł też być włączany i wyłączany przez zmianę stopnia utlenienia.

Patrząc z perspektywy późniejszych wydarzeń, druga właściwość wyznacza początek chemioterapii. Jeśli związek wiąże się z jednym rodzajem tkanki, a z innym nie, to ten sam związek mógłby docierać do jednego rodzaju organizmu, a do innego nie. Ehrlich sformułował ten wniosek wprost: jeśli patogen można wybarwić selektywnie, barwienie mogłoby wskazywać na swoiste szkodliwe działanie wobec tego patogenu. Barwnik mógłby zatem posłużyć jako lek skierowany przeciw intruzowi, a nie przeciw pacjentowi.

Pierwsza próba u pacjenta nie dotyczyła malarii. W 1890 roku Ehrlich wraz z psychiatrą Arthurem Leppmannem doniósł, że błękit metylenowy łagodzi ból w stanach neuralgicznych i reumatycznych mięśni, stawów oraz ścięgien. Obaj rozważali, czy lek mógłby działać na choroby psychiczne, i postanowili tego nie sprawdzać. Włoski lekarz Pietro Bodoni z Genui mimo to podjął taką próbę. Tytuł jego pracy z 1899 roku odnosi się do działania uspokajającego w różnych postaciach psychozy: opisał uspokojenie u czternastu pobudzonych pacjentów i odnotował, że inni lekarze w Genui już stosowali barwnik w tym samym celu. Działanie uspokajające nie jest działaniem na samą chorobę, a to rozróżnienie powraca w tej historii.

Badania nad malarią rozpoczęły się w 1891 roku, we współpracy z patologiem Paulem Guttmannem, w szpitalu Moabit w Berlinie. Błękit metylenowy podano dwóm pacjentom, a doniesienie ukazało się w Berliner klinische Wochenschrift z 28 września 1891 roku. W pierwszym przypadku pacjent przyjął jednorazowo 0.5 g barwnika wieczorem 29 czerwca; oczekiwany napad nie rozwinął się w pełni, a jedyną później odnotowaną dolegliwością była łagodna stranguria z niebieskim zabarwieniem moczu. Napady gorączki ustąpiły w pierwszych dniach, a pasożyty zniknęły z krwi najpóźniej do ósmego dnia. Sami autorzy podsumowali, że ich oczekiwania zostały całkowicie spełnione. Dwa przypadki bez kontroli nie stanowią dowodu. Pełniejsze omówienie błękitu metylenowego i malarii, obejmujące współczesne badania, znajduje się na osobnej stronie. Tutaj interesujące pytanie jest węższe: ile z rozumowania Ehrlicha przetrwało konfrontację z pasożytem.

Gdzie rozumowanie się sprawdziło, a gdzie zawiodło

Z proponowanego mechanizmu przetrwało niewiele, przynajmniej w postaci przedstawionej przez Ehrlicha. Uporządkowana wersja, według której płaski trójpierścieniowy kation wsuwa się między pary zasad DNA pasożyta, nie wytrzymuje konfrontacji z Plasmodium. Błękit metylenowy jest tak łatwo redukowany przez zakażoną krwinkę czerwoną, że w ogóle nie dociera do pasożyta jako płaski kation. Wyjaśnienie oparte na interkalacji, pasujące do barwników akrydynowych, nie pasuje do tego barwnika.

Obraz poparty dowodami jest mniej uporządkowany. Błękit metylenowy hamuje reduktazę glutationową pasożyta przy stężeniach osiągalnych u pacjenta. Blokuje przemianę hemu w hemozoinę — obojętny pigment wytwarzany przez pasożyta, by uniknąć zatrucia produktami własnego trawienia hemoglobiny — mniej więcej tak skutecznie jak chlorochina i znacznie skuteczniej niż chinina. Jego cykliczne przemiany redoks wytwarzają też reaktywne formy tlenu w komórce, która już je produkuje. Nadal nie rozstrzygnięto, który z tych mechanizmów jest właściwy ani czy wszystkie mają swój udział.

Istnieje jeszcze jedna komplikacja, którą należy uwzględniać przy odczytywaniu wszelkich historycznych twierdzeń o tym związku. Dostępny w handlu błękit metylenowy z tamtego okresu nie był jedną substancją. Próbki zawierały Azure B, pokrewny związek z usuniętą jedną grupą metylową, a w starszych roztworach gromadziło się go więcej. Azure B jest barwnikiem metachromatycznym o innych miejscach docelowych: barwi dwuniciowe DNA na ciemnoniebiesko, a RNA na zielono. Mieszanina dwóch barwników trafiających w różne miejsca, w proporcjach, których nikt nie odnotował, nie pozwala jednoznacznie stwierdzić, co robił zawarty w niej błękit metylenowy.

Sam barwnik nigdy nie wyparł chininy. Metoda poradziła sobie lepiej. Uczeń Ehrlicha, Wilhelm Roehl, pracujący dla koncernu barwnikowego i farmaceutycznego IG Farben, nadal rozwijał pochodne barwników jako leki na choroby tropikalne i dostarczył brakujące narzędzie: kanarka zakażonego ptasią malarią jako rutynowy model przesiewowego badania potencjalnych związków. Werner Schulemann następnie zmodyfikował łańcuch boczny, a powstała sól fenotiazyniowa wyleczyła zakażenie doświadczalne. Nadal jednak barwiła pacjentów na niebiesko.

Trwałym rezultatem okazał się nie barwnik ani układ pierścieni, lecz łańcuch boczny. Dodanie grupy dialkiloaminoalkiloaminowej zmieniło zachowanie cząsteczki, a ten fragment przetrwał wszystkie późniejsze modyfikacje. Zachowanie tej grupy i zastąpienie pierścienia fenotiazyniowego akrydynowym daje chinakrynę. Wprowadzenie pierścienia chinolinowego daje chlorochinę. Pamachina, prymachina i amodiachina, wszystkie nadal obecne wśród leków przeciwmalarycznych, zawierają tę samą grupę. Związek, który nie sprawdził się jako lek, dostarczył fragmentu, który odniósł sukces.

Związek z lekami przeciwpsychotycznymi prowadzi przez pierścień, a nie przez sam lek. To wyjaśnienie struktury błękitu metylenowego doprowadziło Heinricha Augusta Bernthsena w 1883 roku do macierzystego szkieletu fenotiazyny. Nad tym szkieletem, modyfikowanym różnymi podstawnikami, pracowali chemicy w Rhône-Poulenc w latach 40. XX wieku, poszukując leków przeciwhistaminowych. Jeden z tych związków zsyntetyzowano pod koniec 1950 roku i przetestował go chirurg Henri Laborit, który zauważył, że pacjenci pozostawali po nim spokojni i obojętni. Pierwsze opublikowane zastosowanie psychiatryczne, u pacjenta z manią, miało miejsce w styczniu 1952 roku. Pierwszy lek przeciwpsychotyczny jest więc nie tyle potomkiem przeciwmalarycznego środka Ehrlicha, ile dalekim krewnym barwnika, od którego Ehrlich zaczął.

Trzy zasady, które warto zachować z tej historii

1. „Pierwszy syntetyczny lek stosowany w medycynie” opisuje kategorię, a zastrzeżenia są szersze, niż sugeruje to sformułowanie. Zwrot ten utrwalił się w piśmiennictwie; często cytowany przegląd Schirmera i współpracowników w Neurobiology of Aging nazywa błękit metylenowy pierwszym w pełni syntetycznym lekiem stosowanym w medycynie. Wodzian chloralu wprowadzono jako syntetyczny środek uspokajający w 1869 roku, ponad dwadzieścia lat wcześniej. Sama praca z 1891 roku dostarcza części odpowiedzi, ponieważ autorzy wymieniają syntetyczne leki przeciwgorączkowe, które już wcześniej zawiodły przeciw malarii, w tym chinolinę, antypirynę i antyfebrynę. Opracowany przez Ehrlicha związek arsenowy przeciw kile pojawił się jeszcze później. Wersja tego twierdzenia, którą można obronić, dotyczy metody, a nie pierwszeństwa: błękit metylenowy należy do najwcześniejszych związków syntetycznych wybranych do działania przeciw określonemu organizmowi na podstawie chemicznej teorii selektywności.
2. Selektywne rozmieszczenie nie oznacza selektywnej korzyści. Wynik Ehrlicha z 1886 roku pokazał, że barwnik trafia do tkanki nerwowej. To, dokąd związek trafia, i to, co robi po dotarciu na miejsce, są dwoma różnymi pomiarami, a pierwszy jest znacznie łatwiejszy do przeprowadzenia. W tej luce od tamtej pory mieści się większość twierdzeń dotyczących błękitu metylenowego i mózgu.
3. Czystość należy do dowodów, nie do marketingu. Historyczne dane są niejednoznaczne właśnie z tego powodu. Niewielkie różnice strukturalne zmieniają to, dokąd trafia ten związek. Dlatego certyfikat analizy musi być powiązany z konkretną partią, a nie przedstawiany jako ogólna deklaracja, że produkt jest badany. Sprzedawca deklarujący zgodność z monografią farmakopealną, a badający wyłącznie metale ciężkie, twierdzi więcej, niż potwierdza raport. Blupreme pozyskuje błękit metylenowy od producenta farmaceutycznego i bada pełną specyfikację określoną w monografii: tożsamość, czystość, zanieczyszczenia organiczne, pozostałości rozpuszczalników, zanieczyszczenia pierwiastkowe, pozostałość po prażeniu, limity mikrobiologiczne i endotoksyny bakteryjne. Raport jest publikowany przy produkcie, a strona o błękicie metylenowym klasy USP wyjaśnia te limity oraz to, dlaczego w pierwszej kolejności należy szukać wyniku dotyczącego Azure B.

Chronologiczny wykaz źródeł

Chronologię najważniejszych wydarzeń, obejmującą chemię barwników sprzed prac Ehrlicha oraz klasy jakości i specyfikacje opracowane po nim, przedstawiono osobno w historii błękitu metylenowego. Tożsamość samego związku omówiono w artykule wyjaśniającym, czym jest błękit metylenowy.

Ilustracje, na których opiera się ten opis, reprodukowane w przeglądzie Krafts, Hempelmann i Skórskiej-Stani z 2012 roku, nie mają jednakowej wartości, a jeden przykład pokazuje dlaczego. Ilustracja z 1891 roku jest pierwotnym zapisem próby; umieszczony obok portret z 1910 roku dokumentuje jedynie reputację z tego okresu. Strony z notatnika Andersaga z 1934 roku są bezpośrednim śladem zastąpienia pierścienia chinolinowym, zapisanym ręką samego chemika.

Uczciwe podsumowanie eksperymentów Ehrlicha z barwnikami brzmi tak: trafnie rozpoznał selektywność i cel, ale pomylił się co do mechanizmu. Błękit metylenowy rzeczywiście gromadzi się w tkance nerwowej i rzeczywiście szkodzi pasożytowi malarii. Nie robi jednak drugiego z powodu pierwszego, a chemiczne wyjaśnienie, które Ehrlich zaproponował dla obu zjawisk, było błędne. To, co wykazał bezspornie, okazało się trwalsze niż poprawny mechanizm: związek można wybrać, zamiast przypadkiem odkryć, a wyboru dokonać na podstawie dowodów zebranych, zanim ktokolwiek poda go pacjentowi.