Błękit metylenowy, tau i amyloid: dlaczego mechanizmy usuwania białek się różnią

Zapytaj, co błękit metylenowy robi z białkami związanymi z chorobą Alzheimera, a usłyszysz jedną stanowczą odpowiedź tam, gdzie powinny paść trzy odpowiedzi z zastrzeżeniami. W probówce zakłóca łączenie się tau ze sobą. W jednym modelu mysim obniża poziom rozpuszczalnego amyloidu, nie wpływając na tau. W innym ogranicza aktywność enzymu, który w ogóle umożliwia powstawanie amyloidu. Każda z tych obserwacji jest rzeczywista. Żadna nie przedstawia całego obrazu i nie wszystkie występują u tego samego zwierzęcia w tym samym czasie. Ten artykuł rozdziela te trzy obserwacje, aby wynik jednego eksperymentu przestał być przytaczany jako dowód na wynik innego.

Czytelnicy, którzy chcą poznać szerszy obraz tego, jak błękit metylenowy działa wewnątrz komórek, powinni zacząć od tamtego artykułu. Ci, którzy chcą wiedzieć, czy którekolwiek z tych zjawisk pomogło pacjentom, powinni przeczytać przegląd badań klinicznych w chorobie Alzheimera — to tam jest miejsce na wyniki badań u ludzi. Ten artykuł nie powtarza tego przeglądu.

Wynik dotyczący tau pochodzi z testów agregacji

Najstarszy z tych trzech wątków pochodzi z badań w układach bezkomórkowych nad tau, białkiem tworzącym splątki neurofibrylarne. W teście wiązania tau–tau fragmenty tau łączą się w parzyste włókna helikalne, a barwniki fenotiazynowe, w tym błękit metylenowy, blokują ten proces przy niskich stężeniach mikromolowych. Późniejsze badania biochemiczne dostarczyły chemicznego wyjaśnienia: barwnik utlenia reszty cysteinowe w tau, co stabilizuje formę monomeryczną i hamuje powstawanie fibryli, które w przeciwnym razie by się rozrastały. Raportowane stężenia hamujące agregację tau wynoszą w przybliżeniu od kilku do kilkudziesięciu mikromoli na litr — to zakres istotny dla wszystkiego, co opisano dalej.

Zwróć uwagę, jakiego rodzaju jest to stwierdzenie. Nie mówi nic o produkcji tau, fosforylacji tau w żywym mózgu ani o usuwaniu tau. Mówi, że w określonych warunkach w probówce utleniony barwnik zapobiega układaniu się cząsteczek tau w większe struktury. To wynik precyzyjny, wąski i użyteczny. Problem zaczyna się wtedy, gdy rozszerza się go do ogólnego stwierdzenia, że błękit metylenowy usuwa patologię tau, ponieważ dane z badań na zwierzętach nie potwierdzają takiej wersji.

Wynik dotyczący proteasomu pochodzi z badań myszy 3xTg-AD i oddzielił amyloid od tau

Eksperyment, który najczytelniej pokazał rozbieżność między punktami końcowymi, to 16-tygodniowe badanie z podawaniem substancji w paszy myszom z trzema mutacjami związanymi z chorobą Alzheimera. Zwierzęta od szóstego miesiąca życia jadły paszę zawierającą błękit metylenowy, a badacze mierzyli jednocześnie trzy rzeczy: aktywność proteasomu, poziomy amyloidu i tau.

Aktywność proteasomu się zmieniła. Aktywność chymotrypsynopodobna wzrosła o około jedną czwartą, a trypsynopodobna o około połowę, podczas gdy trzecia aktywność katalityczna nie zmieniła się istotnie. Poziomy rozpuszczalnego amyloidu beta 40 i 42 spadły każdy o około jedną czwartą. Autorzy zinterpretowali to jako zwiększone usuwanie, a nie zmniejszoną produkcję, ponieważ białko prekursorowe i fragmenty powstające w wyniku jego przetwarzania nie zmieniły się, a uczenie się i pamięć poprawiły się w próbie testowej w labiryncie wodnym.

Następnie pojawiły się rozbieżności. Nierozpuszczalny amyloid nie uległ zmianie. Barwienie blaszek nie wykazało zmian. Całkowite ludzkie tau i tau fosforylowane przy treoninie 181 nie zmieniły się, podobnie jak nieprawidłowa lokalizacja tau. Parametry mitochondrialne również się nie zmieniły: nie stwierdzono istotnego wpływu na aktywność oksydazy cytochromu c, ilość białka tej oksydazy ani ATP. Zatem w tym modelu, przy tym schemacie podawania, błękit metylenowy zwiększył dwie z trzech aktywności proteasomu, obniżył poziom rozpuszczalnego amyloidu, poprawił wynik pomiaru behawioralnego i pozostawił bez zmian punkty końcowe dotyczące tau, nierozpuszczalny amyloid oraz badane parametry mitochondrialne.

Jedno zastrzeżenie raczej wyostrza ten wniosek, niż go osłabia. U tych myszy w badanym wieku nie rozwinęły się jeszcze agregaty tau, więc eksperyment nie może wykazać, że błękit metylenowy nie działa na splątki tau. Pokazuje natomiast, że poziom rozpuszczalnego amyloidu może spaść, podczas gdy mierzone punkty końcowe dotyczące tau pozostają bez zmian. Właśnie takich wyników — jedno białko się zmieniło, drugie nie — potrzeba w tym temacie. Jeśli uważasz, że aktywacja proteasomu przez błękit metylenowy usuwa jednocześnie oba charakterystyczne białka, to badanie koryguje ten pogląd.

Wynik dotyczący produkcji amyloidu pochodzi z badań starzejących się myszy PSAPP i przeczy poprzedniemu mechanizmowi

Inny zespół, inny model i przeciwne wyjaśnienie dotyczące wcześniejszego etapu procesu. W trzymiesięcznym badaniu z podawaniem przez sondę dożołądkową 15-miesięcznym myszom PSAPP codzienna dawka doustna 3 mg/kg zmniejszyła obciążenie blaszkami w różnych obszarach mózgu o około jedną trzecią do połowy i obniżyła poziomy kilku frakcji amyloidu, w tym oligomerów oznaczanych w specjalnie przeznaczonym do tego teście. Tutaj jednak proponowanym mechanizmem była zmniejszona produkcja, a nie szybsze usuwanie: poziom białka BACE1 w mózgu spadł, poziom jego produktu C99 również spadł, natomiast poziom informacyjnego RNA nie uległ zmianie. Wskazuje to na efekt na poziomie białka, a nie na zmniejszenie ekspresji genu.

Badania komórkowe wzmocniły tę interpretację. W teście bezkomórkowym z enzymem rekombinowanym błękit metylenowy bezpośrednio hamował BACE1, a w komórkach jajnika chomika wykazujących ekspresję ludzkiego białka prekursorowego amyloidu poziomy wydzielanego amyloidu 40 i 42 spadały już przy stężeniach 1.56 mikromola na litr, podczas gdy sam prekursor pozostawał bez zmian. Porównaj to z poprzednim badaniem, w którym fragmenty powstające w wyniku przetwarzania prekursora nie zmieniły się, a efekt przypisano usuwaniu. Oba wyniki nie mogą opisywać tego samego uniwersalnego mechanizmu, ponieważ różnią się modele, wiek, dawki, drogi podania i czas trwania badań. Właśnie o to chodzi. W jednym układzie wpływ błękitu metylenowego na amyloid wynika ze zmian jego produkcji, a w innym — z jego usuwania. Przytaczanie któregokolwiek z tych wyników bez warunków eksperymentu wprowadza w błąd.

Jedna chemia, kilka celów: wspólny mechanizm utleniania cysteiny

Trzeci kierunek badań wyjaśnia, jak jedna chemia reakcji redoks może ujawniać się w niepowiązanych ze sobą historiach dotyczących białek. W biochemicznym badaniu hamowania kaspaz błękit metylenowy inaktywował kaspazę-6 przez utlenianie jej katalitycznej cysteiny do kwasu sulfenowego, co potwierdzono spektrometrią mas. Stężenie wywołujące połowę maksymalnego efektu wynosiło około 10.6 mikromola na litr. Kaspaza-3 była hamowana przy podobnym stężeniu. Autorzy wyraźnie powiązali to z literaturą dotyczącą tau: ta sama chemia utleniania cysteiny, która według proponowanego wyjaśnienia utrzymuje tau w formie monomerycznej, może wyłączyć proteazę cysteinową, a skuteczne stężenia pokrywają się.

To eleganckie wyjaśnienie, ale również ostrzeżenie. Cząsteczka aktywna w reakcjach redoks, która utlenia dostępne reszty cysteinowe, przy każdym stężeniu wywołującym aktywność będzie oddziaływać na więcej niż jeden cel. Wątek dezagregacji tau, wątek kaspaz i być może inne łączy ten sam chemiczny czasownik, ale z różnymi rzeczownikami. Ten wspólny czasownik nie sprawia, że wyniki są wymienne. Oznacza, że dawka i kontekst decydują, który cel ma znaczenie, a przewlekłe podawanie ukierunkowane na jeden proces zależny od cysteiny może wpływać także na inne. Autorzy badania kaspaz bezpośrednio zwrócili na to uwagę. Powiązane pytania o to, jak chemia redoks błękitu metylenowego decyduje o jego celach, co aktywacja proteasomu oznacza dla innych zagregowanych białek oraz czy długotrwałe podawanie zmienia profil celów działania, zasługują na osobne omówienie.

Mechanizmy według punktów końcowych: który wynik należy do którego modelu

Czytaj tabelę wiersz po wierszu, a wniosek będzie jasny. Nie ma ani jednego wiersza, w którym zmiana występuje w każdej kolumnie. Najmocniejszy wynik dotyczący produkcji amyloidu pochodzi z badania, w którym w ogóle nie badano proteasomu. Najmocniejszy wynik dotyczący proteasomu pochodzi z badania, w którym przetwarzanie prekursora ani drgnęło. Wynik dotyczący tau opiera się głównie na doświadczeniach w probówkach i chemii reakcji wspólnej z enzymami spoza zamierzonego celu działania. Kto łączy te kolumny w jedno twierdzenie — że błękit metylenowy usuwa patologiczne białka jako całą klasę — ten pisze przegląd eksperymentu, którego nigdy nie przeprowadzono.

Ta dyscyplina interpretacji dotyczy także pacjentów. To, czy te mechanizmy przekładają się na korzyść kliniczną, jest osobnym pytaniem, z własnymi badaniami i własnymi wnioskami. Odpowiedź znajduje się w przeglądzie dowodów klinicznych dotyczących choroby Alzheimera, a nie tutaj.