Błękit metylenowy a stwardnienie rozsiane: co sprawdzano w badaniach na zwierzętach

Gdy szukasz informacji o błękicie metylenowym w SM, trafiasz na prace, które pozornie odpowiadają na to samo pytanie. Tak jednak nie jest. W jednej pracy podawano błękit metylenowy chorym myszom jako leczenie. W drugiej nie leczono nim żadnego zwierzęcia. Używano go jako niebieskiego barwnika na cienkich skrawkach rdzenia kręgowego, aby patolog mógł zobaczyć mielinę pod mikroskopem.

Na tym rozróżnieniu opiera się cały artykuł. Barwnik pełni w biologii dwie role, które nie mają ze sobą nic wspólnego poza zawartością butelki. Jako kandydat na lek jest podawany żywemu zwierzęciu, a pytanie brzmi: czy zmienia przebieg choroby? Jako barwnik jest nanoszony na martwą, utrwaloną tkankę po zakończeniu eksperymentu, a pytanie brzmi: jak wyglądała ta tkanka? Jeśli przeoczysz tę różnicę, odczytasz opis metod badania patologicznego tak, jakby przedstawiał wynik leczenia.

Czym jest EAE — proste wyjaśnienie

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zwykle określane skrótem EAE, to standardowy model zwierzęcy wykorzystywany do badania wybranych aspektów stwardnienia rozsianego. Badacz immunizuje podatną mysz fragmentem białka mieliny wraz z silnym adiuwantem. Następnie układ odpornościowy atakuje własny ośrodkowy układ nerwowy zwierzęcia. U myszy rozwija się wstępujące osłabienie, które łatwo ocenić w skali od 0 do 5 — od wiotkiego ogona po porażenie tylnych kończyn.

Łatwość tej oceny wyjaśnia zarówno popularność EAE, jak i to, dlaczego model ten może wprowadzać w błąd. SM u ludzi rozwija się samoistnie, obejmuje szerszy i mniej precyzyjnie określony zestaw celów odpowiedzi immunologicznej oraz wywołuje objawy wzrokowe, czuciowe, poznawcze, móżdżkowe i ruchowe, w przebiegu rzutowym lub postępującym. EAE odtwarza wybrane mechanizmy, takie jak zapalenie, demielinizacja i uszkodzenie aksonów, w kontrolowanych warunkach. Nie odtwarza SM w miniaturze. Czytelnicy, którzy chcą poznać ogólny kontekst, mogą najpierw zapoznać się z proponowanym działaniem błękitu metylenowego na poziomie komórkowym, zanim ocenią jakiekolwiek twierdzenie dotyczące konkretnej choroby.

W dwóch omawianych poniżej pracach zastosowano również różne antygeny do wywołania EAE, co ma znaczenie. W badaniu leczenia chorobę wywołano za pomocą MOG35-55, krótkiego peptydu glikoproteiny mieliny oligodendrocytów. W badaniu patologii chorobę wywołano za pomocą MP4, białka fuzyjnego złożonego z fragmentów zasadowego białka mieliny i białka proteolipidowego. Wybór szczepu i antygenu wpływa na umiejscowienie zmian oraz charakter zapalenia, więc te dwa badania nie są dwoma powtórzeniami jednego eksperymentu.

Mapa: od modelu przez pytanie do ograniczeń

Miej tę tabelę pod ręką. To podstawowe zestawienie porównawcze tego artykułu. Każdy wiersz wskazuje, na jakie pytanie kliniczne model może pomóc odpowiedzieć, co rzeczywiście mierzono i gdzie kończy się możliwość odnoszenia wyników do ludzi.

Każdy, kto sprawdza kolejny nagłówek, może wykorzystać te same kolumny z pomocą poradnika jak czytać badania przedkliniczne: zapytać o gatunek i antygen, rolę związku, punkty końcowe oraz o to, czy wynik opisuje przebieg choroby, czy obraz tkanki w jednym momencie.

Wynik badania leczenia: co zmieniło podawanie związku

W badaniu leczenia z 2016 roku opublikowanym w Journal of Neuroimmunology wykorzystano samice myszy C57BL/6 w wieku około 8 do 10 tygodni, immunizowane 250 mikrogramami MOG35-55 na mysz. Po wywołaniu EAE zwierzęta losowo przydzielono do grupy otrzymującej błękit metylenowy lub do nieleczonej grupy EAE, a ocenę kliniczną prowadzono do około 30. dnia.

Od 15. do 30. dnia wyniki oceny klinicznej były istotnie niższe u leczonych myszy niż w grupie kontrolnej EAE, przy P mniejszym niż 0.01. Analiza rdzenia kręgowego wskazywała na podobny kierunek zmian: u leczonych zwierząt stwierdzono mniejsze nacieki zapalne, mniejszą demielinizację i mniejszą utratę aksonów.

Wyróżniającym elementem był zestaw pomiarów szlaków sygnałowych. Leczenie zwiększało aktywację AMPK i ekspresję SIRT1 oraz hamowało aktywację NF-kB, jednego z głównych regulatorów zapalenia. W obrębie odporności adaptacyjnej osłabiało odpowiedź Th17 i wzmacniało odpowiedź Treg. Proponowany ciąg zależności wygląda więc następująco: błękit metylenowy, następnie AMPK i SIRT1, słabsza sygnalizacja NF-kB, przesunięcie od prozapalnej odpowiedzi Th17 ku regulatorowej odpowiedzi Treg, łagodniejsze uszkodzenie tkanek i niższe wyniki oceny klinicznej.

Ten ciąg zależności jest interpretacją, a nie udowodnioną sekwencją przyczynowo-skutkową. Badanie pokazuje, że podawaniu leku towarzyszyły zmiany sygnalizacji i złagodzenie przebiegu choroby. Nie dowodzi, że AMPK i SIRT1 odpowiadają za całość korzyści, a publicznie indeksowany tekst nie podaje dokładnej dawki w miligramach na kilogram, drogi podania, dnia rozpoczęcia ani czasu trwania na tyle jasno, by można było odtworzyć schemat wyłącznie na podstawie streszczenia. Każdą dawkę przytoczoną w związku z tą pracą na stronie sprzedażowej traktuj jako niezweryfikowaną, chyba że wskazano opis metod w pełnym tekście. W szerszym zbiorze danych dotyczących błękitu metylenowego u ludzi należy sprawdzić, czy ten wczesny sygnał dotyczący odporności doczekał się potwierdzenia w danych klinicznych.

Wynik badania patologii: co wykazała obserwacja tkanek przez sześć miesięcy

W badaniu MP4 z 2015 roku opublikowanym w PLoS ONE wykorzystano samice myszy C57BL/6 immunizowane 200 mikrogramami MP4 w kompletnym adiuwancie Freunda oraz toksyną krztuścową w dniu immunizacji i ponownie 48 godzin później. Żadne zwierzę nie otrzymało błękitu metylenowego jako leku. Po utrwaleniu i zatopieniu tkanki poprzeczne skrawki rdzenia kręgowego o grubości jednego mikrometra barwiono błękitem metylenowym do mikroskopii świetlnej, a dla uzyskania dokładniejszych szczegółów badano sznur przednio-boczny za pomocą mikroskopii elektronowej.

Tkanki pobierano na trzech etapach: w szczycie ostrej fazy od 7 myszy, trzy miesiące po wystąpieniu objawów od 5 myszy i sześć miesięcy po wystąpieniu objawów od 10 myszy. Średnie wyniki oceny klinicznej na tych etapach wyglądały niemal identycznie: około 1.7 do 1.8 w skali od 0 do 5. Obraz tkanek mówił jednak co innego. Gęstość włókien z izolowanym uszkodzeniem mieliny wzrosła z około 569,000 włókien na milimetr kwadratowy w szczycie ostrej fazy do około 1,496,000 po sześciu miesiącach; porównanie ostrej fazy z odległym punktem czasowym było istotne przy P równym 0.027. Łączne uszkodzenie mieliny i aksonów wzrosło w przybliżeniu dwukrotnie po sześciu miesiącach. Włókna podlegające remielinizacji stanowiły mniej niż jeden procent na każdym etapie, co jest trzeźwiącym szczegółem w kontekście nadziei na naprawę.

Nasilenie uszkodzenia aksonów układało się w krzywą o kształcie litery U: było wysokie w szczycie ostrej fazy, niższe po trzech miesiącach i najwyższe po sześciu miesiącach. Korelowało z obrzękiem mitochondriów i zmniejszeniem odstępów między neurofilamentami. Ocenę prowadzono bez znajomości wyniku klinicznego i etapu choroby, co wzmacnia interpretację, że wyniki oceny klinicznej nie odzwierciedlały w pełni postępującego uszkodzenia struktur.

Ta rozbieżność jest rzeczywistym wkładem badania z perspektywy czytelnika zainteresowanego SM. Stabilny wynik oceny niepełnosprawności nie oznaczał stabilnego stanu tkanek. Pokazuje też, dlaczego ta praca nie może uzasadniać żadnego twierdzenia o leczeniu SM błękitem metylenowym. Badano wpływ czasu, a nie leczenia.

Dlaczego żadne z badań nie potwierdza korzyści u pacjentów

Traktuj każdą z tych prac jako dobre źródło odpowiedzi na wąskie pytanie, ale nie jako odpowiedź na pytanie dotyczące pacjentów.

Po pierwsze, przyczyna jest inna. EAE wywołuje się celowo za pomocą określonego antygenu i adiuwantu. SM u ludzi rozwija się samoistnie z udziałem szerszego repertuaru mechanizmów odpornościowych, obejmującego limfocyty T, limfocyty B, odporność wrodzoną i miejscowe komórki glejowe. Związek, który zmienia odpowiedź myszy ukierunkowaną na MOG, nie musi zmieniać tej szerszej odpowiedzi u ludzi.

Po drugie, fenotyp jest inny. Wstępujące osłabienie u myszy, obejmujące najpierw ogon, a następnie tylne kończyny, jest wygodnym wskaźnikiem. Sprowadza jednak różnorodność ludzkiego SM do jednej liczbowej oceny funkcji ruchowych. Leki często zmieniają krótkoterminowe wyniki oceny EAE bez wpływu na przebieg choroby u ludzi, dlatego EAE jest narzędziem do badań przesiewowych i analizy mechanizmów, a nie miniaturową kliniką.

Po trzecie, kwestie ekspozycji i czasu pozostają nierozstrzygnięte. Ciągłe podawanie związku od wczesnego etapu w 30-dniowym eksperymencie na myszach nie jest tym samym co przewlekłe przyjmowanie doustne przez osobę z rozwiniętą chorobą, a w żadnym badaniu nie mierzono stężenia leku w układzie nerwowym. Bez tego ogniwa nie ma podstaw, by przejść od stężenia w naczyniu laboratoryjnym lub dawki u myszy do schematu stosowania u ludzi.

Po czwarte, te dwie prace nie powtarzają wzajemnie swoich wyników. Różne antygeny, różne pytania, różne punkty końcowe, a w jednym przypadku w ogóle brak leczenia. Cytowanie ich łącznie jako dwóch pozytywnych badań leczenia SM jest błędem kategorialnym.

Co to oznacza dla czytelników oceniających dowody

Te prace nie ustanawiają żadnego protokołu stosowania błękitu metylenowego w SM. Badanie leczenia uzasadnia dalsze badania nad AMPK, SIRT1, NF-kB oraz równowagą Th17 i Treg w modelu MOG EAE. Badanie patologii przypomina, że uszkodzenie tkanek może postępować mimo pozornie niezmiennych wyników oceny klinicznej, a błękit metylenowy w opisie metod czasem oznacza pojemnik z barwnikiem, nie zawartość apteczki. Czytelnicy śledzący trwające badania nad stwardnieniem rozsianym powinni pamiętać o tym rozróżnieniu między barwnikiem a lekiem. Kwestie bezpieczeństwa, w tym ryzyko związane z krwią i interakcjami, należy omówić z lekarzem, uwzględniając ogólne dane dotyczące bezpieczeństwa błękitu metylenowego, zanim ktokolwiek podejmie działania na podstawie nagłówków o wynikach laboratoryjnych.

Sedno można ująć w jednym zdaniu. W jednym cytowanym badaniu podawano błękit metylenowy myszom z MOG EAE i opisano łagodniejszy przebieg choroby wraz z przesunięciem odpowiedzi immunologicznej w kierunku przeciwzapalnym, natomiast w drugim cytowanym badaniu nie podawano żadnego leczenia i używano błękitu metylenowego wyłącznie do barwienia rdzenia kręgowego, dokumentując sześć miesięcy narastającego uszkodzenia mieliny i aksonów, więc te dwie prace nie dowodzą, że błękit metylenowy pomaga w SM u ludzi.