Czy błękit metylenowy może omijać mitochondrialny kompleks III? Dlaczego badania dają sprzeczne wyniki

Dwa laboratoria sprawdziły, czy błękit metylenowy może omijać zablokowany mitochondrialny kompleks III. Jedno odpowiedziało: nie. Drugie: tak. Oba dysponowały danymi.

Pierwsze badanie, na mitochondriach mózgu myszy, wykazało, że barwnik nie może tego zrobić. Drugie, na mitochondriach mózgu trzech gatunków gryzoni, wykazało, że częściowo może. Trzecie badanie, na wątrobie myszy, często przywołuje się w tym kontekście, ale sprawdzało ono coś innego. Wystarczy przypisać mu właściwe miejsce, by wyjaśnić połowę nieporozumień.

Nie ma tu uniwersalnego mechanizmu, który można by ogłosić. Są trzy eksperymenty z różnymi inhibitorami, dawkami i mierzonymi parametrami. Najpierw przyjrzyj się warunkom. Dopiero potem wnioskom.

Co oznacza tutaj omijanie

Elektrony wchodzą do łańcucha przez kompleks I (z NADH) lub kompleks II (z bursztynianu), przechodzą przez kompleks III do cytochromu c, a następnie przez kompleks IV do tlenu. Powstający po drodze gradient jest tym, co komórka wykorzystuje do wytwarzania ATP.

Twierdzenie o omijaniu oznacza, że błękit metylenowy odbiera elektrony przed miejscem blokady i przekazuje je za nim. Utleniony barwnik przyjmuje elektrony od NADH lub początkowych elementów łańcucha, przekształcając się w leukobłękit metylenowy, a forma zredukowana przekazuje je cytochromowi c lub z powrotem do łańcucha. Jeśli przekazanie następuje za miejscem blokady, oddychanie i potencjał błonowy częściowo się odtwarzają. Jeśli następuje w miejscu blokady lub przed nim, nic się nie odtwarza.

Jeden szczegół dotyczący kompleksu III ma duże znaczenie dla tego sporu. Kompleks prowadzi cykl Q z dwoma miejscami wiązania inhibitorów. Antymycyna wiąże się z miejscem Qi. Myksotiazol wiąże się z miejscem Qo. Badanie wykorzystujące tylko jeden z nich sprawdza tylko połowę kompleksu.

Badanie pierwsze: brak omijania w mitochondriach mózgu myszy

Gureev i współpracownicy wykorzystali mitochondria kory mózgowej myszy C57BL/6, izolowane przy użyciu digitoniny, badane przy stężeniu białka 0.1 mg na ml. Zastosowano trzy warianty substratów: pirogronian z jabłczanem, każdy w stężeniu 5 mM, bursztynian w stężeniu 10 mM z glutaminianem w stężeniu 2 mM oraz L-prolinę w stężeniu 10 mM. Inhibitorami były rotenon w stężeniu 1 mikromolarnym (kompleks I) i antymycyna w stężeniu 1 mikrogram na ml (kompleks III). Stężenia barwnika wynosiły 0.5, 1 i 2 mikromolarne, przy czym głównym stężeniem było 1 mikromolarne. Metody i zapisy pomiarów przedstawiono w komunikacie w FEBS Letters.

Omijanie kompleksu I zadziałało. Rotenon zmniejszył oddychanie stymulowane ADP z około 121 do około 2 nmol na minutę na mg, a barwnik w stężeniu 1 mikromolarnym przywrócił je do około 21. Potencjał błonowy odtworzył się przy pirogronianie z jabłczanem oraz przy L-prolinie.

Omijanie kompleksu III nie zadziałało. Antymycyna zmniejszyła oddychanie do około 16, a barwnik zwiększył je jedynie do około 20. Potencjał błonowy nie odtworzył się przy żadnym substracie, nawet przy stężeniach barwnika do 5 mikromolarnych. Dane dotyczące nadtlenku wskazywały na to samo: sam barwnik zwiększał emisję nadtlenku z poziomu podstawowego bliskiego 76 pmol na minutę na mg do około 1170, 1460 i 1945 przy trzech stężeniach, ale antymycyna zmniejszała ten wywołany barwnikiem sygnał odpowiednio o około 25, 88 i 96 procent. Gdyby zredukowany barwnik reagował bezpośrednio z tlenem, zablokowanie kompleksu III nie powinno tłumić sygnału. Autorzy wywnioskowali, że zredukowany barwnik jest utleniany w miejscu Qo kompleksu III, przed blokadą wywołaną antymycyną. Krótka pętla, opisana słownie: donory przekazują elektrony barwnikowi, barwnik przekazuje je do Qo, a dalej biegną one normalną drogą. Blokada rotenonem jest omijana. Blokada antymycyną — nie.

Badanie drugie: częściowe omijanie u trzech gatunków, przy obu miejscach wiązania inhibitorów

Svab i współpracownicy rozszerzyli schemat badania. Wykorzystali mitochondria mózgu myszy, szczurów i świnek morskich, izolowane z użyciem Percollu, badane przy takim samym stężeniu 0.1 mg na ml, z pirogronianem i jabłczanem lub glutaminianem i jabłczanem, każdy w stężeniu 5 mM. Zastosowali dwa inhibitory kompleksu III: antymycynę A w stężeniu 0.3 mikromolarnym i myksotiazol w stężeniu 1 mikromolarnym. Barwnik miał stężenie 2 mikromolarne w większości testów i 0.5 mikromolarne w doświadczeniach z cytochromem c. Wyniki dla wszystkich trzech gatunków, uzyskane według odpowiadających sobie protokołów, przedstawiono w publikacji w otwartym dostępie.

Obie blokady były częściowo omijane u wszystkich trzech gatunków. W mitochondriach myszy antymycyna hamowała oddychanie, a barwnik zwiększał je o około 60 procent, z około 37 do 59 nmol na minutę na mg. Myksotiazol hamował je o 88 procent, do około 4.5, a barwnik zwiększał je pięciokrotnie, do około 23. Przy każdym z inhibitorów następowała częściowa repolaryzacja błony. Mierzono ją dwoma barwnikami (safraniną O i ratiometrycznym TMRM), aby wykluczyć artefakty optyczne.

W tej pracy bezpośrednio sprawdzono także przekazywanie elektronów, czego nie zrobiono w pierwszym badaniu. Egzogenny acetylowany cytochrom c w stężeniu 25 mikromolarnym nie był redukowany przez mitochondria w stanie energetyzacji, ani z inhibitorami, ani bez nich, ale dodanie barwnika wywoływało redukcję w obu przypadkach. W buforze bezkomórkowym NADH z barwnikiem redukowały cytochrom c z szybkością proporcjonalną do stężenia NADH. Dłuższy przeskok, opisany słownie: równoważniki redukcyjne trafiają do barwnika, barwnik przekazuje elektrony bezpośrednio cytochromowi c, a kompleks IV — tlenowi. Ta droga całkowicie pomija kompleks III, więc pozwala ominąć oba inhibitory.

Dwa dodatkowe pomiary wspierają tę interpretację. Po dodaniu barwnika do mitochondriów traktowanych myksotiazolem fluorescencja NAD(P)H spadała, co oznacza, że równoważniki redukcyjne odpływały nową drogą. Z kolei absorbancja barwnika przy 660 nm odzwierciedlała kolejne dodatki, a analiza supernatantów po wirowaniu wykazała ponad stukrotną akumulację utlenionego barwnika wewnątrz mitochondriów w stanie energetyzacji, po której barwnik opuszczał mitochondria, gdy potencjał zanikał. Bilans protonów również pasuje: pominięcie etapów pompowania pozostawia około 2 protonów na parę elektronów zamiast 10. Szybsze zużycie tlenu przy jedynie częściowej repolaryzacji odpowiada więc rzeczywistemu omijaniu, a nie stanowi dowodu przeciw niemu.

Ten sam preparat dawał odpowiedzi, które pokazują ryzyko pobieżnej interpretacji. Przy inhibitorze i barwniku ADP obniżało oddychanie, zamiast je zwiększać, a blokada transportu stymulowała je, zamiast spowalniać, podczas gdy potencjał błonowy nadal zmieniał się w typowych kierunkach. Samo zużycie tlenu w tym układzie wprowadza w błąd.

Badanie trzecie: badanie wątroby, które dotyczyło kompleksów I i II, nie III

Lee i Boelsterli wykorzystali mitochondria wątroby myszy oraz hodowane hepatocyty uszkodzone przez efawirenz (kompleks I, IC50 bliskie 30 mikromolarnemu) i hydrazynę, metabolit izoniazydu (kompleks II, IC50 bliskie 30 mikromolarnemu). Barwnik w stężeniu około 30 mikromolarnym przywracał utlenianie NADH, potencjał błonowy i ATP, jednocześnie zmniejszając poziom utleniaczy i śmierć martwiczą. Publikacja w Redox Biology przedstawia to w modelu, w którym barwnik przenosi elektrony z pominięciem uszkodzonych kompleksów I i II.

Ten wynik stanowi potwierdzony kontekst dotyczący wcześniejszych etapów łańcucha i nie mówi nic o kompleksie III, ponieważ nie był on w tym badaniu blokowany. Nie może ani potwierdzić, ani podważyć żadnego z badań mózgu.

Zestawienie warunków

Cztery powody, dla których oba badania kompleksu III mogą być trafne w odniesieniu do własnych warunków

1. Inhibitory nie stanowiły tej samej interwencji. Sama antymycyna w stężeniu 1 mikrogram na ml w porównaniu z antymycyną w stężeniu 0.3 mikromolarnym oraz osobnym inhibitorem miejsca Qo. Droga, w której barwnik dostarcza elektrony do miejsca Qo, zawodzi dokładnie tam, gdzie droga bezpośrednio do cytochromu c działa. Jedno miejsce nie może reprezentować obu.

2. Dawka barwnika i czas pomiaru były różne. Główne stężenia wynosiły 1 i 2 mikromolarne, a chodzi o związek podlegający cyklom redoks, którego wychwyt i bezpośrednia redukcja cytochromu c zależą od stężenia i czasu. Niewielkie różnice dawek wraz z różnym czasem pomiaru mogą ujawniać różne odcinki tej samej sieci.

3. Preparaty były różne. Izolacja z użyciem digitoniny i izolacja w gradiencie Percollu wyodrębniają populacje mitochondriów, które częściowo się pokrywają, ale nie są identyczne. Stężenie białka było takie samo, 0.1 mg na ml, więc ta zmienna odpada, ale subpopulacja i integralność mitochondriów — nie. Wykluczono też gatunek jako podejrzaną przyczynę: druga grupa odtworzyła swój fenotyp również u myszy.

4. Warunki substratowe określają, co może zrobić barwnik. Trzy warianty substratów w porównaniu z parami związanymi z NADH. Dostępność NADH i potencjał błonowy wspólnie określają, jak szybko barwnik jest redukowany i gdzie się rozmieszcza, a droga wymagająca zredukowanego barwnika obok utlenionego cytochromu c jest uzależniona od tego wyboru.

Jak oceniać kolejne twierdzenie o omijaniu

Zapytaj, który kompleks zablokowano, jakim inhibitorem, w którym miejscu i przy jakiej dawce. Zapytaj o stężenie barwnika i moment wykonania pomiaru. Zapytaj o tkankę, gatunek, metodę izolacji, stężenie białka i substrat. Sprawdź też, czy pomiary potencjału, oddychania, stanu redoks oraz bezpośredniego przekazywania elektronów dają zgodny obraz, ponieważ samo zużycie tlenu więcej niż raz wskazywało tutaj błędny kierunek.

Wąskie podsumowanie pozostaje aktualne. Omijanie kompleksu I przez barwnik jest zgodnie potwierdzane. W przypadku kompleksu III mitochondria myszy z antymycyną w stężeniu 1 mikrogram na ml i barwnikiem w stężeniu 1 mikromolarnym nie wykazują funkcjonalnego omijania, natomiast u trzech gatunków, przy antymycynie w stężeniu 0.3 mikromolarnym lub myksotiazolu w stężeniu 1 mikromolarnym i barwniku w stężeniu 2 mikromolarnym, obserwuje się częściowe omijanie z bezpośrednim przekazywaniem elektronów z barwnika do cytochromu c. Te stwierdzenia mogą współistnieć. Wszystko, co wykracza poza nie, jest ekstrapolacją.

Powiązane lektury osadzają sporne twierdzenie w bezspornej chemii: jak błękit metylenowy przenosi elektrony — o przekazywaniu elektronów, eksperymenty nad omijaniem kompleksu I — o potwierdzonym przypadku dotyczącym wcześniejszego etapu łańcucha, pomiary potencjału błonowego i ich artefakty — o tym, dlaczego potrzebne były dwa barwniki, oraz laboratoryjne postępowanie ze związkami podlegającymi cyklom redoks — o pułapkach związanych z dawkowaniem i czasem pomiaru.