Błękit metylenowy a ferroptoza: żelazo, peroksydacja lipidów i śmierć komórki

Ferroptoza to śmierć komórki wskutek uszkodzenia błony. Wielonienasycone tłuszcze w błonach utleniają się w reakcji łańcuchowej, błona traci integralność, a komórka umiera. Do tych reakcji chemicznych niezbędne jest żelazo. To zdanie ujmuje całą koncepcję, a wszystko opisane w tym artykule służy sprawdzeniu jednej z jej części.

Pytanie jest tu węższe: co błękit metylenowy robi z tym łańcuchem w eksperymentach na komórkach i co uzyskany wynik faktycznie pokazuje. Krótka odpowiedź brzmi: w dwóch badaniach laboratoryjnych błękit metylenowy w stężeniach nanomolarnych ograniczał peroksydację lipidów mitochondrialnych i utrzymywał komórki przy życiu po zastosowaniu czynników, które bez niego wywołują ferroptozę. Dłuższa odpowiedź jest ważniejsza, ponieważ każde ogniwo łańcucha sprawdzano za pomocą innej interwencji, a każda interwencja ma swoje ograniczenia.

Ferroptoza w jednym akapicie

Fosfolipid błonowy z ogonem z wielonienasyconego kwasu tłuszczowego ma słaby punkt: atomy wodoru, które łatwo oderwać. Gdy rodnik oderwie jeden z nich, tlen przyłącza się do lipidu, powstaje lipidowy rodnik nadtlenkowy, a ten odrywa wodór od kolejnego lipidu. Reakcja rozprzestrzenia się wzdłuż błony, chyba że coś ją zatrzyma.

Głównym mechanizmem zatrzymującym ten proces jest enzym o nazwie GPX4, który wykorzystuje glutation do redukcji nadtlenków lipidów do nieszkodliwych alkoholi lipidowych. Czynniki stosowane w laboratorium atakują tę obronę w określonych punktach. Erastyna blokuje import cystyny przez system xc-minus, przez co komórce brakuje cysteiny do syntezy glutationu. Sulfoksymina butioniny bezpośrednio blokuje syntezę glutationu. RSL3 hamuje sam GPX4. Wszystkie trzy sprawiają, że nadtlenki nie są usuwane, ale działają na różnych etapach, więc wyniku uzyskanego dla jednego czynnika nie można automatycznie uogólniać na pozostałe.

Ferroptoza różni się od apoptozy cechami, które ją definiują. Nie występują w niej kaskada kaspaz ani ciałka apoptotyczne. Chelatory żelaza, takie jak deferoksamina, oraz związki wychwytujące rodniki, takie jak ferrostatyna-1, hamują ten proces. To praktyczny test, na podstawie którego badacze określają śmierć komórki jako ferroptotyczną, a nie jedynie nekrotyczną. Szerszy obraz szlaków regulowanej śmierci komórkowej nadaje temu rozróżnieniu kontekst, a sposób, w jaki komórki gospodarują labilnym żelazem, wyjaśnia, dlaczego chelatacja jest tak rozstrzygającą kontrolą.

Rola mitochondriów i przyczyny sporu

Wczesne prace wykazały, że komórki pozbawione mitochondrialnego DNA nadal ulegają ferroptozie, co sugerowało, że mitochondria nie są do niej konieczne. Późniejsze badania wykazały, że zmniejszenie liczby mitochondriów lub zablokowanie oddychania może hamować ferroptozę wywołaną niedoborem cysteiny, ale nie tę wywołaną bezpośrednim hamowaniem GPX4. Oba wyniki mogą być prawdziwe, jeśli udział mitochondriów zależy od czynnika wyzwalającego, typu komórki i miejsca, w którym zachodzi decydująca peroksydacja.

Badanie stanowiące podstawę tego artykułu podeszło do sporu z wykorzystaniem sondy swoistej dla konkretnego przedziału komórkowego. MitoCLox to kierowana do mitochondriów wersja wskaźnika peroksydacji lipidów: zmienia fluorescencję po zetknięciu z lipidowymi rodnikami nadtlenkowymi wewnątrz mitochondriów. W fibroblastach traktowanych erastyną utlenienie sondy mitochondrialnej pojawiało się w jeszcze żywych komórkach, przed ich śmiercią, a jego stopień był zróżnicowany w obrębie populacji. Ta kolejność ma znaczenie. Peroksydacja poprzedzająca śmierć może być jej przyczyną. Peroksydacja mierzona wyłącznie w martwych komórkach to ślad pozostały po ich obumarciu. Uzupełniający przewodnik po testach peroksydacji lipidów i tym, co wykrywa każda sonda wyjaśnia, dlaczego lokalizacja sondy rozstrzyga o znaczeniu sygnału.

Ten sam wzorzec pojawił się w drugim modelu. Fibroblasty pacjenta z dziedziczną neuropatią nerwu wzrokowego Lebera, z mutacją kompleksu I i wyższym wyjściowym poziomem stresu oksydacyjnego, umierały wskutek ferroptozy po wyczerpaniu glutationu, podczas gdy fibroblasty kontrolne pozostawały odporne. Również tutaj utlenienie sondy mitochondrialnej następowało jako pierwsze. Szczegóły zawiera badanie peroksydacji lipidów mitochondrialnych w ferroptozie na fibroblastach.

Co błękit metylenowy zmienił w tych eksperymentach

Błękit metylenowy jest nośnikiem redoks. Jego forma utleniona przyjmuje elektrony z reakcji związanych z NADH w kompleksie I, a forma zredukowana oddaje je cytochromowi c, który przekazuje je do kompleksu IV. Tworzy to częściowe obejście odcinka łańcucha, w którym elektrony zwykle wyciekają na tlen, tworząc anionorodnik ponadtlenkowy. Czytelnicy, którzy chcą poznać pełny obraz tego przekazywania elektronów, powinni zacząć od tekstu o tym, jak błękit metylenowy przenosi elektrony przez mitochondria.

W fibroblastach płucnych traktowanych erastyną błękit metylenowy w stężeniu 250 nanomolarnym zachowywał żywotność komórek w teście ich przeżywalności, podobnie jak antyoksydanty kierowane do mitochondriów: SkQ1 i MitoTEMPO. Próby kontrolne wyznaczają zakres wniosku. Ferrostatyna-1, alfa-tokoferol i deferoksamina również działały ochronnie, co potwierdza ferroptotyczny charakter śmierci komórek. Analog SkQ1 bez grupy antyoksydacyjnej nie chronił komórek, co wskazuje na reakcje redoks, a nie na nieswoistą akumulację. Ochrona zanikała przy stężeniach SkQ1 powyżej około 200 nanomolarnych, zgodnie ze znanym działaniem prooksydacyjnym antyoksydantów chinonowych przy większych ilościach. Błękit metylenowy wykazuje podobną dwoistość zależną od dawki: w tych hodowlach działa ochronnie przy niskich stężeniach nanomolarnych, ale przy wyższych stężeniach lub silnym oświetleniu może wytwarzać nadtlenek wodoru poprzez cykliczne reakcje redoks. Taki kontekst zależności od dawki omawia tekst o reaktywnych formach tlenu w mitochondriach.

Eksperymenty na izolowanych mitochondriach pozwoliły następnie rozdzielić źródła reaktywnych form tlenu (ROS). W obecności żelaza dwuwartościowego substraty dostarczające elektrony do kompleksu I wraz z rotenonem stymulowały utlenianie sondy. Rotenon blokuje przepływ elektronów za miejscem flawinowym, dlatego poprzedzające go nośniki pozostają zredukowane, a elektrony wyciekają na tlen z flawiny zwróconej w stronę macierzy. Substraty dostarczające elektrony do kompleksu III wraz z antymycyną A powodowały obfite wytwarzanie nadtlenku wodoru, ale nie wywoływały peroksydacji lipidów. Ten sam ogólny sygnał ROS, inna lokalizacja, inny wynik. Zarówno SkQ1, jak i błękit metylenowy hamowały peroksydację napędzaną przez kompleks I, nie hamując samego wytwarzania nadtlenku wodoru. Umiejscawia to ich działanie po powstaniu ROS, na etapie peroksydacji lipidów.

Część badania dotycząca przeciążenia żelazem i wskazówka związana z lipofuscyną

Drugie badanie podeszło do pytania od strony żelaza. W kardiomiocytach H9c2 poddanych działaniu cytrynianu amonowo-żelazowego(III) w stężeniach submilimolarnych pojawiały się mitochondrialne ROS, peroksydacja lipidów mitochondrialnych, a następnie ferroptoza, po której w ciągu 24 godzin gromadził się pigment podobny do lipofuscyny. Lipofuscyna to autofluorescencyjna, zawierająca żelazo pozostałość utlenionych lipidów i białek, która gromadzi się z wiekiem. Jej szybkie pojawienie się w tym modelu łączy ostrą peroksydację napędzaną przez żelazo z klasycznym markerem starzenia. Zarówno błękit metylenowy w stężeniach nanomolarnych, jak i SkQ1 zapobiegały peroksydacji, śmierci komórek oraz gromadzeniu pigmentu. Izolowane mitochondria sercowe potwierdziły ten wzorzec: rotenon wraz z żelazem dwuwartościowym wywoływał peroksydację i sygnał przypominający pigment, a oba związki je blokowały. Pełną sekwencję opisano w badaniu przeciążenia żelazem w kardiomiocytach H9c2. Wątek pigmentu wiąże się z tematem lipofuscyny i markerów starzenia komórkowego.

Czego nie pokazują testy przeżywalności komórek

Pomiar żywotności, taki jak CellTiterBlue, wskazuje, ile komórek w naczyniu hodowlanym pozostaje aktywnych metabolicznie po zastosowaniu czynnika wyzwalającego wraz z potencjalnym związkiem ochronnym. To test mechanizmu w określonym układzie. Nie jest to wynik leczenia. W żadnym z tych eksperymentów nie podawano substancji pacjentowi, nie mierzono punktu końcowego dotyczącego choroby ani nie ustalano okna terapeutycznego w organizmie.

Cztery ograniczenia wymagają wyraźnego wskazania. Po pierwsze, zakres typów komórek jest wąski: transformowane fibroblasty płucne, pierwotne fibroblasty skóry, w tym jedna linia związana z chorobą mitochondrialną, oraz linia szczurzych kardiomiocytów, a także izolowane mitochondria serca szczura. Wrażliwość różniła się między liniami, a linię LHON celowo wybrano ze względu na jej wyjątkową podatność. Po drugie, czynniki wyzwalające stanowią skrajne warunki laboratoryjne: całkowita blokada transportu lub syntezy oraz obciążenia żelazem, na jakie żadna tkanka nie byłaby narażona w ostrych warunkach. Po trzecie, stężenia nie da się przeliczyć prostym mnożeniem. Stężenie nanomolarne w pożywce hodowlanej nie jest dawką dla człowieka, a między naczyniem hodowlanym a organizmem stoją dystrybucja błękitu metylenowego, jego redukcja do bezbarwnej formy we krwi i tkankach, ekspozycja na światło oraz potencjał błonowy. Po czwarte, sondy dostarczają informacji o swoim przedziale komórkowym. Utlenienie MitoCLox pokazuje, że powstały mitochondrialne rodniki lipidowe; nie pokazuje, czy pęknięciu błony komórkowej, prawdopodobnemu zdarzeniu końcowemu, zapobieżono bezpośrednio, czy uniknięto go dzięki działaniu na wcześniejszym etapie.

Rzetelny wniosek jest więc następujący: w tych modelach ROS pochodzące z kompleksu I wraz z żelazem napędzają peroksydację lipidów mitochondrialnych poprzedzającą ferroptozę, a błękit metylenowy w niskich stężeniach przerywa ten odcinek procesu. Wszystko, co wykracza poza ten odcinek, wymaga innych eksperymentów na zwierzętach, a następnie na ludziach.