Alternatywy dla błękitu metylenowego w mikroskopii

W przypadku prostego rozmazu bakteryjnego fiolet krystaliczny może zastąpić błękit metylenowy, gdy celem jest zobaczenie kształtu komórek. W przypadku żywych komórek lepszą alternatywą może być kontrast fazowy bez żadnego barwienia. Wybór zależy od obserwacji, którą trzeba przeprowadzić.

Załóżmy, że dwie osoby badają tę samą hodowlę bakteryjną. Jedna chce odróżnić pałeczki od komórek kulistych. Druga chce ustalić, czy zastosowane działanie zabiło bakterie. Barwnik, który pierwszej osobie zapewnia wyraźny obraz, drugiej może nie dać żadnej użytecznej odpowiedzi.

Przed wyborem zamiennika dokończ to zdanie: „Muszę obserwować ___ w ___, a komórki muszą / nie muszą pozostać żywe.” To zdanie określa zadanie, które musi spełnić metoda barwienia.

Zacznij od preparatu i pytania

Najpierw ustal, czy komórki muszą pozostać żywe, a następnie określ cechę, którą trzeba obserwować:

Komórki muszą pozostać żywe: w przypadku ruchu lub kształtu rozważ kontrast fazowy lub DIC bez barwienia; w przypadku jądrowego DNA rozważ Hoechst 33342 z fluorescencją; w przypadku integralności błony wybierz zwalidowany test, taki jak SYTO 9 z jodkiem propidyny.
Komórki nie muszą pozostać żywe: w przypadku morfologii bakterii rozważ proste barwienie fioletem krystalicznym lub barwienie negatywne nigrozyną; w przypadku reakcji Grama zastosuj pełną metodę barwienia metodą Grama; w przypadku jądrowego DNA w utrwalonych komórkach rozważ fluorescencję DAPI.

Skorzystaj z tej tabeli, aby porównać ograniczenia poszczególnych możliwości. Są to wybory metod, a nie instrukcje dotyczące zamiany odczynników w istniejącym protokole.

Co trzeba obserwować	Preparat i wyposażenie	Potencjalna alternatywa	Główne ograniczenie
Kształt i układ bakterii	Przygotowany rozmaz bakteryjny; jasne pole	Proste barwienie fioletem krystalicznym	Pokazuje morfologię; nie pozwala określić reakcji Grama ani żywotności.
Zarysy komórek na ciemnym tle	Preparat bakteriologiczny; jasne pole	Barwienie negatywne nigrozyną	Sposób przygotowania i skład mają znaczenie; niezabarwiona komórka nie musi być żywa.
Reakcja Grama	Przygotowany rozmaz bakteryjny; jasne pole	Pełna metoda barwienia metodą Grama	Wymaga pełnej sekwencji odczynników i kontroli.
Ruch lub zmiany w żywych komórkach	Odpowiedni preparat mokry; kontrast fazowy lub DIC	Bez barwienia	Wymaga odpowiedniego układu optycznego; kontrast nie identyfikuje konkretnej cząsteczki.
Jądrowe DNA	Utrwalone komórki; fluorescencja	DAPI	Wymaga odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji.
Jądrowe DNA w żywych komórkach	Żywe komórki; fluorescencja	Hoechst 33342	Wnikanie do komórek nie dowodzi, że warunki obrazowania są nieszkodliwe.
Integralność błony bakterii	Nieutrwalone bakterie; fluorescencja	SYTO 9 z jodkiem propidyny	Barwienie błony jest pośrednią miarą żywotności.

W przypadku prostego rozmazu ostrożnie zastępuj metodę

Fiolet krystaliczny jest praktycznym kandydatem, gdy zadaniem jest uzyskanie jednobarwnego obrazu morfologii bakterii. Bacteriological Analytical Manual FDA wymienia dwie formulacje fioletu krystalicznego odpowiednie do prostego barwienia. Stosuj udokumentowaną formulację i właściwą dla niej metodę przygotowania; sama nazwa barwnika nie określa gotowego odczynnika roboczego.

Fiolet krystaliczny jest również stosowany w barwieniu metodą Grama, ale nie oznacza to, że proste barwienie fioletem krystalicznym jest barwieniem metodą Grama. W protokole barwienia metodą Grama ASM wynik różnicujący zależy od kolejnego działania fioletu krystalicznego, jodu, odbarwiania i barwienia kontrastowego. Pominięcie tych etapów zmienia zakres wniosków, jakie można wyciągnąć z obrazu. Więcej informacji o tym rozróżnieniu zawiera artykuł proste barwienie a barwienie metodą Grama.

Nigrozyna pozwala uwidocznić zarysy w inny sposób: przyciemnia tło, podczas gdy komórki bakteryjne pozostają stosunkowo jasne. Instrukcja dotycząca nigrozyny firmy Merck zawiera istotny szczegół, który łatwo pominąć w ogólnej liście zamienników. Określona w niej formulacja robocza zawiera formaldehyd. Nie można więc wnioskować o zgodności z żywymi komórkami wyłącznie na podstawie określenia „barwienie negatywne”, nawet jeśli same komórki wyglądają na niezabarwione. Sprawdź pełny skład i sposób przygotowania preparatu.

W przypadku żywych preparatów rozważ zmianę układu optycznego

Jeżeli chcesz obserwować ruch lub podział komórek, wprowadzenie kolejnego barwnika może komplikować obserwację. Jak wyjaśnia Nikon w przewodniku dotyczącym kontrastu w przezroczystych preparatach, kontrast fazowy i kontrast interferencyjno-różniczkowy, czyli DIC, uwidaczniają preparaty dzięki różnicom w ich właściwościach optycznych. Mogą pokazywać żywe, niezabarwione komórki, pod warunkiem że mikroskop jest wyposażony w wymagane elementy.

Ten wybór pozwala zachować preparat bez barwienia, ale zmienia zakres dostępnych informacji. Można śledzić granicę komórki lub jej ruch bez wiedzy, która cząsteczka odpowiada za powstający kontrast. Jeżeli pytanie dotyczy lokalizacji konkretnej cząsteczki, należy zamiast tego wybrać odpowiednią metodę znakowania.

W przypadku jądrowego DNA porównanie barwników DAPI i Hoechst firmy Invitrogen rozróżnia powszechne stosowanie DAPI w utrwalonych komórkach od łatwiej przenikającego przez błonę Hoechst 33342, preferowanego do znakowania żywych komórek. Oba wymagają wyposażenia do fluorescencji. Żaden nie jest bezpośrednim zamiennikiem barwnego barwnika do mikroskopii w jasnym polu.

Traktuj ekspozycję na barwnik i oświetlenie jako warunki eksperymentalne. Jeżeli mierzysz zachowanie komórek, porównuj preparaty barwione i niezabarwione.

Czerwona komórka nie jest automatycznie martwą komórką

SYTO 9 i jodek propidyny są często stosowane razem do oceny integralności błony bakterii. Podręcznik BacLight wiąże nienaruszone błony z zielonym barwieniem, a uszkodzone błony z barwieniem czerwonym. Taka interpretacja wymaga walidacji dla danego preparatu.

Badanie Rosenberga i współpracowników z 2019 roku pokazuje, na czym polega problem. W 24-godzinnych biofilmach E. coli na szkle, znajdujących się w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, około 96% komórek in situ wyglądało na dodatnie pod względem jodku propidyny. Autorzy oszacowali jednak, że po zebraniu 82% komórek było zdolnych do hodowli. Obrazy konfokalne pokazywały komórki z zielonym wnętrzem znajdujące się pod materiałem zabarwionym na czerwono, co wskazywało na udział pozakomórkowych kwasów nukleinowych w powstawaniu mylącego sygnału.

Te wartości procentowe opisują różne pomiary wykonane na preparatach z tego badania, a nie uniwersalny współczynnik korekcyjny. Praktyczny wniosek polega na sprawdzeniu, co wygenerowało sygnał. W biofilmie barwnik kwasów nukleinowych może wykrywać materiał znajdujący się poza komórkami, a także wewnątrz uszkodzonych komórek. Przy wyciąganiu wniosków dotyczących żywotności badacze zalecają pomiary uzupełniające, takie jak hodowla lub pomiar aktywności metabolicznej, jednocześnie zaznaczając, że każda z tych metod ma ograniczenia.

Sprawdź, co faktycznie zawiera alternatywa

Alternatywna metoda barwienia może nadal zawierać błękit metylenowy. Przykładem jest barwnik Giemsy: Merck opisuje swój produkt jako roztwór azure-eosin-methylene-blue, przeznaczony między innymi do rozmazów krwi i szpiku kostnego. Może to być inna metoda dla innego preparatu, ale nie spełnia wymogu wykluczenia błękitu metylenowego.

Jeżeli wykluczenie danego związku jest częścią eksperymentu, przed porównaniem obrazów sprawdź tożsamość odczynnika i jego formulację. Przewodnik dotyczący błękitu metylowego, błękitu metylenowego i barwników o podobnych nazwach omawia różnice w nazewnictwie.

Zweryfikuj zamianę przed wykorzystaniem wyniku

W przypadku nowej metody wykonaj niewielkie porównanie na reprezentatywnych preparatach z odpowiednią kontrolą. W miarę możliwości zachowaj porównywalne ustawienia mikroskopu. Zapisz formulację odczynnika, sposób przygotowania preparatu, ekspozycję i warunki obrazowania, aby można było zbadać przyczynę uzyskania lepiej wyglądającego obrazu, zamiast po prostu uznać go za lepszy.

Oceniaj powodzenie w odniesieniu do pierwotnego pytania. W przypadku morfologii sprawdź, czy granice i układ komórek nadal można interpretować. W przypadku znakowania jądrowego oceń lokalizację sygnału i tło. W przypadku żywotności wymagaj dowodów wykraczających poza atrakcyjne rozdzielenie kolorów. Szerszy przewodnik dotyczący barwienia błękitem metylenowym i zastosowań laboratoryjnych wyjaśnia, jak obserwacja i przygotowanie preparatu wzajemnie się uzupełniają.

Wybierz alternatywę, która zachowuje pomiar potrzebny w danym zastosowaniu. Kolor jest tylko jedną z właściwości uzyskanego obrazu.