Paul Ehrlich en methyleenblauw: hoe een kleurstof de ontwikkeling van geneesmiddelen mede vormgaf

Paul Ehrlichs bijdrage aan de geneeskunde was geen geneesmiddel. Het was een betoog over hoe je ernaar moest kijken.

In 1878 diende hij een proefschrift in waarvan het eerste deel de titel "De chemische opvatting van kleuring" droeg. Het betoog was dat het kleuren van een weefselcoupe en het verven van een stuk stof dezelfde logica volgen. In beide gevallen hecht de kleur zich door een chemische affiniteit tussen de kleurstof en het materiaal, niet doordat het weefsel absorberend of vettig is, of een vorm heeft die pigment vasthoudt. Ehrlich had als kind gezien hoe zijn neef, de patholoog Karl Weigert, gekleurde coupes prepareerde. Wat zijn aandacht vasthield, waren niet de beelden, maar het feit dat de kleurstof bepaalde waar ze terechtkwam.

Die stelling klinkt bescheiden. Dat is ze niet. Als een kleurstof om chemische redenen aan een weefsel bindt, geeft het kleuringspatroon informatie over de chemie van dat weefsel. Een gekleurd preparaat is dan niet langer een illustratie, maar een meting.

Daar bouwde hij meteen op voort. In 1880 combineerde hij methyleenblauw met zure fuchsine en noemde het mengsel een neutrale kleurstof, een neutralen Farbkörper. Daarmee kon hij verschillende soorten witte bloedcellen onderscheiden, iets wat met de afzonderlijke kleurstoffen die toen in gebruik waren niet lukte. Twee jaar later presenteerde hij een methode met methylviolet voor het kleuren van tuberkelbacillen, en Koch nam die procedure over in zijn eigen werk.

De theorie die deze werkwijzen later een gemeenschappelijke grondslag gaf, is een afzonderlijke kwestie, en de datering ervan wordt vaak ongenuanceerd weergegeven. Ehrlichs zijketentheorie, het idee dat een stof op een cel inwerkt doordat ze chemisch bij elkaar passen, hoort bij de jaren 1890, niet bij de jaren van de kleurstofexperimenten. Het eerdere werk leverde de overtuiging die daaraan voorafging: selectiviteit is chemisch en kan daarom gericht worden gezocht, in plaats van toevallig ontdekt.

Het experiment dat van de kleurstof een kaart maakte

In 1885 publiceerde Ehrlich een monografie over de zuurstofbehoefte van het organisme, met als ondertitel een kleuranalytische studie. Zijn methode bestond uit het injecteren van kleurstoffen waarvan de kleur afhangt van de oxidatietoestand, om vervolgens te vergelijken hoe verschillende organen ze reduceerden of onveranderd lieten. De kleurstof werd gebruikt als meetinstrument, zoals een thermometer: ze gaf informatie over omstandigheden in weefsel die niet rechtstreeks konden worden onderzocht. Ehrlich omschreef het doel zelf als het bepalen van het reducerende vermogen van levende organen met behulp van bepaalde kleurstoffen.

Het resultaat met methyleenblauw volgde in 1886, in een artikel over de reactie van de kleurstof met levend zenuwweefsel, dat hij in december van het voorgaande jaar aan een medisch genootschap had voorgelezen. Methyleenblauw werd in de bloedsomloop van een levend dier gebracht. Vervolgens werden dunne weefselcoupes verwijderd en aan lucht blootgesteld, zodat de opgehoopte kleurloze kleurstof weer tot de blauwe vorm oxideerde en zichtbaar maakte waar ze zich had verzameld. Zenuwcellen en zenuwvezels namen de kleur aan, en deden dat zo selectief dat de techniek een standaardmethode werd om zenuwweefsel zichtbaar te maken. De verbinding was niet langer slechts een kleurstof die op een dood weefselpreparaat op een werkbank werd aangebracht. Ze was een marker die zich binnen een levend lichaam verdeelde, en die verdeling kon worden afgelezen.

De eigenschap die aan beide experimenten ten grondslag ligt, verdient een duidelijke uitleg, omdat al het andere in dit verhaal ervan afhangt. Methyleenblauw kan omkeerbaar van vorm veranderen. De gereduceerde vorm, leucomethyleenblauw, is kleurloos en verandert bij contact met zuurstof weer in het blauwe kation. Een glucoseoplossing met de kleurstof in een afgesloten pot is kleurloos; open de pot en ze wordt blauw. Ehrlich zou dit rechtstreeks hebben aangetoond door gekleurde coupes zowel met ijzerchloride te behandelen als aan lucht bloot te stellen en te kijken hoe de kleur terugkeerde. Een kleurstof die van kleur verandert met de redoxtoestand van haar omgeving, is een sonde voor die omgeving.

Zo stonden twee eigenschappen naast elkaar. Een kleurstof kon het ene weefsel van het andere onderscheiden. En een kleurstof kon worden aan- en uitgezet door een verandering in oxidatietoestand.

Achteraf bezien vormt de tweede eigenschap het begin van de chemotherapie. Als een verbinding aan het ene soort weefsel bindt en niet aan het andere, zou diezelfde verbinding het ene soort organisme kunnen bereiken en het andere niet. Ehrlich formuleerde die gevolgtrekking rechtstreeks: als een ziekteverwekker selectief kon worden gekleurd, kon die kleuring wijzen op een specifieke schadelijke werking op die ziekteverwekker. Een kleurstof zou dus bruikbaar kunnen zijn als geneesmiddel, gericht tegen een indringer in plaats van tegen de patiënt.

De eerste test bij een patiënt was niet voor malaria. In 1890 meldde Ehrlich samen met de psychiater Arthur Leppmann dat methyleenblauw pijn verlichtte bij neuralgische en reumatische aandoeningen van spieren, gewrichten en pezen. De twee bespraken of het geneesmiddel mogelijk op psychische aandoeningen kon inwerken en besloten het niet te proberen. Een Italiaanse arts, Pietro Bodoni uit Genua, deed dat toch. De titel van zijn artikel uit 1899 verwijst naar een sederende werking bij verschillende vormen van psychose: hij beschreef kalmering bij veertien geagiteerde patiënten en merkte op dat andere artsen in Genua de kleurstof al voor hetzelfde doel gebruikten. Sedatie is geen effect op de aandoening zelf, en dat onderscheid duikt in deze geschiedenis steeds opnieuw op.

Het malariaonderzoek volgde in 1891, samen met de patholoog Paul Guttmann, in het Moabit-ziekenhuis in Berlijn. Twee patiënten kregen methyleenblauw, en het verslag verscheen in de Berliner klinische Wochenschrift van 28 september 1891. In het eerste geval nam de patiënt op de avond van 29 juni in één keer 0.5 g van de kleurstof in; de verwachte aanval kwam niet volledig tot ontwikkeling, en de enige klacht die daarna werd genoteerd was lichte strangurie met blauwe urine. De koortsaanvallen verdwenen in de eerste dagen, en uiterlijk op de achtste dag waren de parasieten uit het bloed verdwenen. De auteurs vatten het zelf samen met de conclusie dat hun verwachtingen volledig waren uitgekomen. Twee gevallen zonder controlegroep leveren geen bewijs. Het uitgebreidere verhaal over methyleenblauw en malaria, inclusief de moderne onderzoeken, hoort op een eigen pagina. De interessante vraag hier is beperkter: hoeveel van Ehrlichs redenering bleef overeind toen ze aan de parasiet werd getoetst?

Waar de redenering standhield en waar ze faalde

Van het voorgestelde mechanisme bleef weinig overeind, althans niet in de vorm waarin Ehrlich het beschreef. De overzichtelijke versie, waarin een vlak tricyclisch kation tussen de basenparen van het DNA van de parasiet schuift, houdt bij Plasmodium geen stand. Methyleenblauw wordt door een geïnfecteerde rode bloedcel zo gemakkelijk gereduceerd dat het de parasiet helemaal niet als vlak kation bereikt. Het intercalatiemodel dat bij de acridinekleurstoffen past, past niet bij deze kleurstof.

Wat de gegevens wel ondersteunen, is minder overzichtelijk. Methyleenblauw remt het glutathionreductase van de parasiet bij concentraties die bij een patiënt kunnen worden bereikt. Het blokkeert de omzetting van heem in hemozoïne, het inerte pigment dat de parasiet vormt om vergiftiging door zijn eigen vertering van hemoglobine te voorkomen, ongeveer even effectief als chloroquine en veel effectiever dan kinine. De redoxcyclus van methyleenblauw genereert bovendien reactieve zuurstofverbindingen in een cel die deze al produceert. Welk van deze processen het eigenlijke mechanisme is, of dat ze allemaal bijdragen, staat nog niet vast.

Er is nog een complicatie, en die moet meewegen bij het lezen van elke historische bewering over deze verbinding. Het commercieel verkrijgbare methyleenblauw uit die periode was niet één enkele stof. Monsters bevatten azure B, de mono-gedemethyleerde verwante verbinding, en in oudere oplossingen hoopte zich meer daarvan op. Azure B is een metachromatische kleurstof met andere doelwitten: ze kleurt dubbelstrengs DNA diepblauw en RNA groen. Een mengsel van twee kleurstoffen met verschillende bestemmingen, in verhoudingen die niemand vastlegde, kan geen eenduidige uitspraak onderbouwen over wat het methyleenblauw daarin deed.

De kleurstof zelf verdrong kinine nooit. De methode deed het beter. Ehrlichs leerling Wilhelm Roehl, die werkte voor het kleurstoffen- en geneesmiddelenconcern IG Farben, bleef kleurstofderivaten naar voren schuiven als geneesmiddelen voor tropische ziekten en leverde het ontbrekende hulpmiddel: de kanarie, geïnfecteerd met vogelmalaria, als routinetest voor kandidaatverbindingen. Werner Schulemann veranderde vervolgens de zijketen, en het daaruit voortgekomen fenothiaziniumzout genas de experimentele infectie. Patiënten werden er nog steeds blauw van.

Het blijvende resultaat bleek noch de kleurstof, noch het ringsysteem te zijn, maar de zijketen. De toevoeging van een dialkylaminoalkylaminogroep veranderde het gedrag van het molecuul, en dat fragment bleef behouden bij elke latere herziening van de structuur. Behoud die groep en vervang de fenothiaziniumring door een acridine, en het resultaat is quinacrine. Vervang die door een chinoline, en het resultaat is chloroquine. Pamaquine, primaquine en amodiaquine, die allemaal nog tot het arsenaal aan antimalariamiddelen behoren, dragen dezelfde groep. De verbinding die als behandeling tekortschiet, leverde het onderdeel dat wel slaagde.

De verbinding met de antipsychotica loopt via de ring, niet via het geneesmiddel. Het ophelderen van de structuur van methyleenblauw bracht Heinrich August Bernthsen in 1883 bij de fenothiazinekern. Aan dat basisskelet, met verschillende substituenten, werkten chemici bij Rhône-Poulenc in de jaren 1940 tijdens hun zoektocht naar antihistaminica. Een van die verbindingen werd rond het einde van 1950 gesynthetiseerd en getest door de chirurg Henri Laborit, die opmerkte dat patiënten er kalm en onverschillig van werden. Het eerste gepubliceerde psychiatrische gebruik, bij een patiënt met manie, volgde in januari 1952. Het eerste antipsychoticum is niet zozeer een afstammeling van Ehrlichs antimalariamiddel als wel een verre verwant van de kleurstof waarmee hij begon.

Drie gewoonten uit deze episode die het behouden waard zijn

1. "Eerste synthetische geneesmiddel dat in de geneeskunde werd gebruikt" beschrijft een categorie, en de kanttekeningen zijn groter dan de formulering doet vermoeden. De uitdrukking is ingeburgerd geraakt; een veelgeciteerd overzichtsartikel van Schirmer en collega's in Neurobiology of Aging noemt methyleenblauw het allereerste volledig synthetische geneesmiddel dat in de geneeskunde werd gebruikt. Chloraalhydraat werd in 1869 als synthetisch kalmeringsmiddel geïntroduceerd, meer dan twintig jaar eerder. Het artikel uit 1891 geeft zelf een deel van het antwoord, doordat de auteurs de synthetische koortswerende middelen noemen die al tegen malaria waren geprobeerd en hadden gefaald, waaronder chinoline, antipyrine en antifebrine. Ehrlichs eigen arseenverbinding tegen syfilis kwam nog later. De verdedigbare versie van de bewering gaat over de methode, niet over wie de eerste was: methyleenblauw behoort tot de vroegste synthetische verbindingen die op basis van een chemische theorie over selectiviteit werden gekozen om tegen een specifiek organisme te werken.
2. Selectieve verdeling is geen selectief voordeel. Ehrlichs resultaat uit 1886 was dat de kleurstof naar zenuwweefsel gaat. Waar een verbinding terechtkomt en wat ze daar doet, zijn twee verschillende metingen, en de eerste is veel gemakkelijker uit te voeren. In die kloof bevinden zich sindsdien de meeste beweringen over methyleenblauw en de hersenen.
3. Zuiverheid hoort bij de bewijsvoering, niet bij de marketing. Juist daarom is het historische materiaal dubbelzinnig. Kleine structuurverschillen veranderen waar deze verbinding terechtkomt. Daarom moet een analysecertificaat aan een specifieke partij zijn gekoppeld, in plaats van te worden aangeboden als een algemene verklaring dat een product is getest. Een verkoper die beweert aan de farmacopeemonografie te voldoen, maar alleen op zware metalen test, beweert meer dan het rapport onderbouwt. Blupreme betrekt methyleenblauw van een farmaceutische fabrikant en test de volledige specificatie uit de monografie: identiteit, zuiverheid, organische onzuiverheden, restoplosmiddelen, elementaire onzuiverheden, gloeirest, microbiële limieten en bacteriële endotoxinen. Het rapport wordt bij het product gepubliceerd, en de pagina over methyleenblauw van USP-kwaliteit legt die limieten uit en waarom het resultaat voor azure B het eerste is waarnaar je moet kijken.

Een chronologisch bronnenoverzicht

De chronologische reeks mijlpalen, inclusief de kleurstofchemie van vóór Ehrlich en de kwaliteitsklassen en specificaties van na zijn tijd, wordt afzonderlijk uiteengezet in de geschiedenis van methyleenblauw. De identiteit van de verbinding zelf wordt behandeld in wat methyleenblauw is.

De afbeeldingen waarop dit verhaal steunt, gereproduceerd in het overzichtsartikel uit 2012 van Krafts, Hempelmann en Skórska-Stania, zijn niet gelijkwaardig. Eén voorbeeld laat zien waarom. De afbeelding uit 1891 is de primaire vastlegging van de proef; het portret uit 1910 ernaast dateert een reputatie en niets meer. Pagina's uit Andersags notitieboek uit 1934 vormen het directe spoor van de chinolinesubstitutie, in het eigen handschrift van de chemicus.

De eerlijke samenvatting van Ehrlichs kleurstofexperimenten is dat hij de selectiviteit en het doelwit juist had, maar het mechanisme verkeerd. Methyleenblauw concentreert zich inderdaad in zenuwweefsel en schaadt inderdaad de malariaparasiet. Het doet het tweede niet vanwege het eerste, en de chemische verklaring die hij voor beide gaf, was onjuist. Wat hij onomstotelijk aantoonde, was duurzamer dan een correct mechanisme: een verbinding kan worden gekozen in plaats van gevonden, en worden gekozen op basis van gegevens die zijn verzameld voordat iemand haar aan een patiënt toedient.