Oplosbaarheid van methyleenblauw en bereiding van oplossingen: een laboratoriumgids

Twee laboratoriummedewerkers bereiden elk een methyleenblauwoplossing van 1 procent uit poeder. De ene weegt 1.00 gram af en vult de maatkolf aan tot 100 mL. De andere weegt 1.00 gram af, voegt dit toe aan 100 mL water en beschouwt de bereiding als voltooid. Een derde medewerker weegt 1.00 gram van een andere partij af en krijgt een meetbaar andere concentratie. Alle drie de flessen hebben hetzelfde etiket. Geen ervan bevat precies wat het etiket vermeldt, en de verschillen komen voort uit drie begrippen die gemakkelijk worden verward: hoeveel het oplosmiddel kan oplossen, wat het afgewogen poeder daadwerkelijk is en waarop het percentage betrekking heeft.

Deze gids gaat uitsluitend over bereidingen voor laboratoriumgebruik: kleuroplossingen, indicatoren, analytische voorraadoplossingen en werkverdunningen. Het is geen recept voor orale of injecteerbare geneesmiddelen, en de hier vermelde concentraties mogen niet als doseringen worden opgevat.

Wat oplosbaarheid bepaalt, en wat niet

De oplosbaarheid van methyleenblauw in water is hoog voor een kleurstof. Het stofgegevensblad voor methyleenblauw op PubChem vermeldt ongeveer 43.6 gram per liter bij 25 C, wat overeenkomt met 4.36 gram per 100 mL, of 4.36 procent w/v. Een onafhankelijk onderzoek naar de evenwichtsoplosbaarheid bij dezelfde temperatuur mat 43.21 g/L en bevestigde de oudere waarde binnen de experimentele foutmarge.

Dat getal is een bovengrens, geen streefwaarde. Een voorraadoplossing van 1 procent bevat 10 g/L, minder dan een kwart van de bovengrens. Een voorraadoplossing van 0.1 procent bevat 1 g/L, ongeveer een veertigste daarvan. Als na goed mengen bij kamertemperatuur vaste deeltjes achterblijven in een bereiding van 1 procent, ligt het probleem vrijwel nooit bij de oplosbaarheidsgrens. Meestal gaat het om onvoldoende bevochtiging, koud water, poederklonten die meer tijd nodig hebben of een opgeloste stof die verkeerd is geïdentificeerd. Warm water en roeren verhelpen de meeste van deze problemen. Als de oplossing is verwarmd, laat de maatkolf dan terugkeren naar de kalibratietemperatuur voordat je aanvult tot het eindvolume.

De oplosbaarheid in andere oplosmiddelen is lager en de waarden verschillen sterker tussen bronnen, deels doordat de hydraatvorm van het geteste materiaal verschilt. Water blijft het referentieoplosmiddel voor gangbare laboratoriumvoorraadoplossingen. Ethanol lost de kleurstof op, maar kan aanzienlijk minder opnemen dan water; chloroform lost deze ook op, pyridine slechts in geringe mate en di-ethylether vrijwel niet. Aceton en ethylacetaat liggen in meetreeksen ver onder water. Beschouw bij niet-waterige toepassingen elke handboekwaarde als een eerste schatting en controleer deze met de daadwerkelijk gebruikte partij, in plaats van de waarde als grens voor de bereiding te gebruiken. De praktische conclusie is eenvoudig: voor een vastgelegde waterige concentratie van maximaal 1 procent biedt water een ruime marge.

Het poeder is niet één vaste vorm

Methyleenblauwpoeder voor laboratoriumgebruik is een chloridezout dat water in zijn kristalrooster bevat, en de hoeveelheid van dat water varieert. Het watervrije ion heeft een molecuulmassa van 319.85 g/mol. Het vaak vermelde trihydraat heeft een molecuulmassa van 373.90 g/mol en het pentahydraat van 409.93 g/mol. Deze waarden staan in de gegevens uit de USP-monografie die bij het PubChem-gegevensblad zijn samengevat.

Commerciële flessen zijn vaak geëtiketteerd als trihydraat, CAS 7220-79-3, maar onderzoek aan de vaste stof heeft aangetoond dat het werkelijke materiaal een pentahydraat, een gedeeltelijk hydraat met ongeveer 2.2 watermoleculen, een dihydraat of een monohydraat kan zijn. In sommige analyses is geen afzonderlijke kristallijne trihydraatfase gevonden. De kleurstof is ook hygroscopisch, waardoor het watergehalte van een geopende fles verandert. Voor kwalitatieve kleuring maakt dit nauwelijks verschil. Voor kwantitatief analytisch werk is het zeer belangrijk. Daarom stelt de uitleg over het lezen van gehalte en watergehalte op een analysecertificaat dat het partijdocument leidend is, niet het woord trihydraat op het voorste etiket.

Hieruit volgen twee manieren om te corrigeren, waarvan er slechts één tegelijk mag worden gebruikt. Als het certificaat het gehalte en het watergehalte of droogverlies vermeldt, gebruik die waarden dan rechtstreeks. Als er geen certificaatgegevens beschikbaar zijn en de concentratie moet worden uitgedrukt als watervrij equivalent, pas dan de theoretische hydraatfactor toe: 373.90 gedeeld door 319.85, of 1.169, voor nominaal trihydraat, en 409.93 gedeeld door 319.85, of 1.282, voor nominaal pentahydraat. Pas niet beide correcties tegelijk toe. Dan wordt het water dubbel meegerekend.

Wat procent betekent

Procent w/v betekent gram van de gespecificeerde opgeloste stof per 100 mL eindoplossing, niet per 100 mL water waarmee je begint. Dus 1 procent w/v is 1.000 g per 100 mL eindvolume, gelijk aan 10 mg/mL of 10 g/L. Een oplossing van 0.1 procent bevat 0.100 g per 100 mL eindvolume, gelijk aan 1 mg/mL. De veelvoorkomende verwarring van 1 procent met 1 mg/mL levert een fout met een factor tien op. Het is daarom verstandig elk etiket hierop te controleren.

Het tweede deel van de definitie is de specificatie van de opgeloste stof. Een oplossing van 1 procent op basis van afgewogen trihydraatpoeder en een oplossing van 1 procent uitgedrukt als watervrij equivalent zijn verschillende oplossingen. De uitgewerkte voorbeelden hieronder vermelden telkens zowel het eindvolume als de basis. Die gewoonte voorkomt het hierboven beschreven probleem met de drie laboratoriummedewerkers.

Uitgewerkte bereidingen, met vermelding van de hydraataannames

Alle voorbeelden gaan uit van zuiver poeder van het genoemde hydraat en water als oplosmiddel bij kamertemperatuur. Schaal voor andere volumes lineair.

Voorbeeld A: 100.0 mL van 1 procent w/v, op basis van afgewogen trihydraat. Weeg 1.000 g methyleenblauwtrihydraat af. Voeg ongeveer 70 mL gezuiverd water toe, roer of zwenk tot alles is opgelost, breng de oplossing kwantitatief over in een maatkolf van 100.0 mL en voeg ook het spoelwater toe. Vul daarna met water aan tot de maatstreep. De opgeloste stof is het trihydraat zelf, dus er is geen correctie voor de molecuulmassa nodig. Resultaat: 1.000 g per 100.0 mL eindvolume, of 10 mg/mL op basis van afgewogen poeder.

Voorbeeld B: 100.0 mL van 1 mg/mL, op basis van watervrij equivalent, uit nominaal trihydraat. Het doel is 100.0 mg watervrij methyleenblauw in 100.0 mL eindvolume. Vermenigvuldig met 1.169 om te corrigeren voor de drie watermoleculen: 100.0 mg maal 1.169 is 116.9 mg. Weeg 116.9 mg nominaal trihydraat af, los het op in ongeveer 70 mL water en vul in een maatkolf aan tot 100.0 mL eindvolume. Voor nominaal pentahydraat is de factor 1.282, zodat voor hetzelfde doel 128.2 mg nodig is. Vermeld op het etiket welke factor is gebruikt.

Voorbeeld C: methyleenblauw verdunnen van een voorraadoplossing van 1 procent naar 0.1 procent. Gebruik C1V1 is gelijk aan C2V2. Om 100.0 mL van 0.1 procent te bereiden uit een voorraadoplossing van 1.0 procent, is het benodigde volume voorraadoplossing 0.1 maal 100.0 gedeeld door 1.0, oftewel 10.0 mL. Pipetteer 10.0 mL van de voorraadoplossing van 1 procent in een maatkolf van 100.0 mL en vul met water aan tot de maatstreep. Voor analisten die de voorkeur geven aan massa-eenheden: 1 procent is 10 mg/mL, dus 10.0 mL bevat 100 mg, en 100 mg in 100.0 mL eindvolume is 1 mg/mL, oftewel 0.1 procent.

Voorbeeld D: 1.000 L werkoplossing van 10 mg/L uit een voorraadoplossing van 1 mg/mL. Een voorraadoplossing van 1 mg/mL is 1000 mg/L. Het benodigde volume is 10 maal 1.000 gedeeld door 1000, oftewel 0.0100 L of 10.0 mL. Pipetteer 10.0 mL voorraadoplossing en verdun met water tot 1.000 L eindvolume. Vanuit een voorraadoplossing van 1 procent met 10,000 mg/L is voor hetzelfde doel slechts 1.00 mL nodig, aangevuld tot 1.000 L. Seriële verdunning in twee stappen geeft een betere nauwkeurigheid dan één overdracht op microliterschaal wanneer de verhouding groter is dan ongeveer honderd.

Elk van deze voorbeelden is alleen een volledige specificatie doordat het drie gegevens bevat: de afgewogen massa met de bijbehorende hydraataanname, het eindvolume van de oplossing en de basis van de vermelde concentratie. Een notitie in een laboratoriumschrift waarin één van deze drie ontbreekt, kan niet exact worden gereproduceerd.

Een werkwijze die de gebruikelijke fouten voorkomt

Los het poeder eerst op in minder dan het eindvolume en vul daarna aan tot volume. Als je poeder rechtstreeks aan het volledige eindvolume water toevoegt, ontstaat een oplossing waarvan het totale volume boven de bedoelde maatstreep ligt, en valt de concentratie te laag uit. Spoel de beker na in de maatkolf, zodat er geen kleurstof achterblijft. Door de intense kleur zijn kleine verliezen zichtbaar, wat een voordeel is als het aanzet tot kwantitatief overbrengen.

Meng totdat er geen deeltjes meer over zijn voordat je aanvult tot volume, en controleer tegen het licht. Filtreer alleen als de methode dit voorschrijft. Methyleenblauw adsorbeert aan sommige membraanmaterialen, waardoor filtratie de concentratie van een net gestandaardiseerde voorraadoplossing kan verlagen. Dit is vastgelegd in onderzoeken naar membraanadsorptie en is belangrijk om te onthouden wanneer filtratie of concentratiecontrole deel uitmaakt van de methode. Als een gefiltreerde voorraadoplossing een gecertificeerde concentratie moet hebben, controleer de concentratie dan na de filtratie in plaats van ervoor.

Bewaar bereide oplossingen bij kamertemperatuur in amberkleurige of ondoorzichtige flessen, beschermd tegen sterk licht. Vermeld op het etiket de opgeloste stof, hydraatbasis, concentratie, het oplosmiddel, de datum en de bereider. Fotobleking bij langdurige belichting is een bekend afbraakproces. Vensterbanken en verlichte koelkasten zijn daarom ongeschikte opslagplaatsen, ook al lijkt de kleurstof stabiel. Verwachtingen over stabiliteit en termijnen voor hercontrole horen bij de richtlijnen voor opslag en stabiliteit van bereide oplossingen. Als praktische regel verdienen analytische voorraadoplossingen echter een verse bereiding of hercontrole, in plaats van er onbeperkt op te vertrouwen.

Werk met het poeder en geconcentreerde voorraadoplossingen met handschoenen, oogbescherming, een laboratoriumjas en bescherming van het werkblad. Gebruik voor flessen een secundaire opvangvoorziening. De kleurstof veroorzaakt snel vlekken op huid, kleding, werkbladen en kunststoffen. Veiligheidsinformatiebladen van leveranciers classificeren het poeder, afhankelijk van de kwaliteit, als schadelijk bij inslikken en irriterend voor ogen en huid. Volledige voorzorgsmaatregelen horen bij de richtlijnen voor veilig hanteren en opslaan, maar het beheersen van kleurstofvlekken is op zichzelf ook een kwaliteitsmaatregel: achtergebleven kleurstof op glaswerk en pipetten is een bron van kruisbesmetting bij sporenanalyse.

Een opmerking over de kwaliteit

Voor kleurbaden en demonstraties voldoet elke schone laboratoriumkwaliteit die op de juiste concentratie is bereid. Voor kwantitatief of vergelijkend werk is de kwaliteit belangrijk, omdat de onzuiverheden verschillen: achtergebleven Azure B en verwante thiazinen, zware metalen, oplosmiddelresten en microbiële belasting. Daarom is het kiezen van een kwaliteit met een volledig analysecertificaat onderdeel van de bereiding en geen bijzaak achteraf. Een volledig partijdocument vermeldt de identiteit, het gehalte met de bijbehorende basis, het watergehalte en de daadwerkelijk onderzochte reeks onzuiverheden. Zo gebruikt de hydraatcorrectie in de bovenstaande voorbeelden gemeten waarden in plaats van de aanname van nominaal trihydraat. Wanneer twee partijen bij dezelfde afgewogen massa verschillende concentraties opleveren, verklaart het certificaat meestal waarom.