Waarom de absorptie van methyleenblauw verandert met de concentratie

Neem een fles voorraadoplossing van methyleenblauw en schenk twee glazen in. Vul het eerste met de voorraadoplossing en het tweede met een tienvoudige verdunning. Het tweede glas is lichter van kleur, zoals verwacht. Kijk goed en er blijkt nog iets veranderd. De tint is verschoven. De ene oplossing neigt naar helder hemelsblauw en de andere naar blauw met een violette zweem. Verdunnen heeft meer gedaan dan de intensiteit verminderen. Het heeft veranderd welke chemische soort het grootste deel van de absorptie voor haar rekening neemt.

Het principe achter die verschuiving is eenvoudig. Opgelost methyleenblauw bestaat niet uit één soort. Het afzonderlijke kleurstofkation, het monomeer, kan zich met zijn vlakke zijde tegen een tweede kation stapelen om een dimeer te vormen, en dimeren kunnen uitgroeien tot grotere aggregaten. Elke vorm heeft zijn eigen absorptiespectrum. Wat een spectrofotometer weergeeft, is de som van het mengsel dat onder die omstandigheden in die cuvet aanwezig is. Verander het mengsel en het spectrum verschuift, ook wanneer het totale kleurstofgehalte een vaste verdunningsverhouding volgt.

Monomeer en dimeer absorberen verschillend

Stel je het monomeer voor als een platte kaart met een positieve lading die over het ringsysteem is verspreid. Twee van zulke kaarten kunnen met hun vlakke zijden tegen elkaar liggen. De positieve ladingen stoten elkaar af, maar de vlakke aromatische oppervlakken trekken elkaar aan door stapelingsinteracties, terwijl het omringende water en de tegenionen de afstoting afschermen. Het resultaat is een gebonden paar met gedeelde elektronische toestanden. De toegestane overgangen liggen bij een hogere energie dan de monomeerovergang, waardoor de dimeerband bij een kortere golflengte verschijnt dan de monomeerband. Grotere aggregaten dragen verder naar de blauwe kant bij als een schouder.

Bij een zeer lage concentratie in schoon water overheersen monomeren en domineert de band bij lange golflengte. Naarmate de totale concentratie stijgt, neemt het aandeel van de gepaarde vorm toe en groeit de band bij kortere golflengte ten opzichte van de eerste. De verhouding tussen de twee banden geeft dus de samenstelling van het mengsel weer, niet rechtstreeks de totale concentratie. Een meting bij één golflengte kan de twee niet onderscheiden zonder een aanname over welke vorm aanwezig is.

Daarom horen referentiespectra altijd bij de bijbehorende omstandigheden. De spectrale referentie voor methyleenblauw vermeldt bandposities samen met het oplosmiddel, de zoutachtergrond, de pH, de temperatuur en het concentratiebereik waarin ze zijn gemeten. Wie een piek noemt zonder die omstandigheden, geeft een onvoldoende gespecificeerde waarde. Twee laboratoria kunnen allebei gelijk hebben over verschillende spectra van dezelfde kleurstof, omdat ze verschillende mengsels hebben gemeten.

Wat het evenwicht verschuift

Concentratie is de belangrijkste stuurfactor. Voor dimeervorming moeten twee monomeren elkaar ontmoeten, dus het aandeel dimeren stijgt sneller dan lineair met de totale hoeveelheid kleurstof. Gerapporteerde dimerisatieconstanten in water liggen rond kamertemperatuur in de orde van duizenden per molar, waardoor het dimeeraandeel binnen het micromolar-bereik sterk toeneemt. Een brede globale fit, van micromolar tot millimolar kleurstof, vond al beneden 34 micromolar een bijdrage van tetrameren die niet nul was. Dat waarschuwt ervoor een model met strikt twee soorten niet zonder meer te vertrouwen bij tientallen micromolar. De exacte fracties hangen af van het medium. Daarom beschrijft dit artikel de richting van veranderingen in plaats van een universele omrekentabel te geven.

Zout is de tweede stuurfactor. Opgeloste ionen schermen de afstoting tussen twee kationen af, waardoor toegevoegd natriumchloride en vergelijkbare elektrolyten het mengsel bij dezelfde kleurstofconcentratie naar dimeren en aggregaten verschuiven. Dit effect is zichtbaar in onderzoeken naar aggregatie van methyleenblauw in zoutoplossingen en waterige media, waarin kleurstofconcentraties van ongeveer 1 micromolar tot 3.4 millimolar werden gemeten bij 0 tot 0.15 molar natriumchloride. In die fit bereikte de tetrameerfractie ongeveer 0.93 bij de combinatie van een hoog kleurstofgehalte en een hoog zoutgehalte. Een spectrum gemeten in water en een spectrum gemeten in fysiologische zoutoplossing zijn dus geen onderling uitwisselbare standaarden.

Temperatuur werkt de andere kant op. Bij stapeling komt gebonden water vrij, terwijl thermische beweging de stapeling tegenwerkt. Verwarming van een oplossing laat daarom doorgaans een deel van de dimeren weer uiteenvallen in monomeren, terwijl afkoeling associatie bevordert. De gefitte dissociatie-enthalpie is negatief, ongeveer minus 30 kilojoules per mole over 282 tot 333 kelvin, wat exotherme associatie bevestigt. Een koud monster dat direct na koeling wordt gemeten, kan sterker geaggregeerd lijken dan hetzelfde monster nadat het op kamertemperatuur is gekomen.

Het oplosmiddel bepaalt de uitgangssituatie. Water bevordert met zijn sterke hydrofobe effect de stapeling van vlakke kleurstofkationen. Alcoholen zoals ethanol en methanol solvateren de ringen beter en breken aggregaten op, waardoor dezelfde kleurstofconcentratie in ethanol meer monomeerkarakter vertoont dan in water. Aprotische co-oplosmiddelen doen hetzelfde: in mengsels van water en DMSO bij 293 kelvin onderdrukte toegevoegd DMSO de dimerisatie. Dat wijst erop dat de waterstructuur de stapeling aandrijft. Bij oppervlakteactieve stoffen is in beide richtingen voorzichtigheid nodig. Boven hun kritische micelconcentratie kunnen micellen afzonderlijke monomeren solubiliseren en een monomeerachtig spectrum herstellen. Onder dat punt kan een tegengesteld geladen oppervlakteactieve stof juist stapeling bevorderen: bij 100 micromolar kleurstof bereikte door SDS aangedreven polymerisatie een piek rond 4 millimolar SDS, ongeveer de helft van de kritische micelconcentratie, voordat bij hogere concentraties van de oppervlakteactieve stof herverdeling optrad. Onderzoek naar effecten van oplosmiddelen en georganiseerde media op methyleenblauwspectra laat zien hoe sterk de directe moleculaire omgeving, en niet alleen de totale concentratie, de waargenomen banden bepaalt.

pH speelt vooral bij de uitersten een rol. In het vrijwel neutrale bereik dat bij de meeste laboratoriumwerkzaamheden wordt gebruikt, blijft methyleenblauw in zijn vertrouwde kationische blauwe vorm en bepaalt aggregatie grotendeels het spectrum. Sterk zure of basische omstandigheden, redoxchemie die de kleurloze leucovorm produceert, of binding aan eiwitten en deeltjes voegen elk toestanden toe buiten het monomeer-dimeerpaar. Verandert een spectrum na toevoeging van een buffer, controleer dan de buffersamenstelling op zouten en bindende componenten voordat je alles aan alleen de pH toeschrijft. De referentie over chemie en protonering behandelt deze vragen over de identiteit afzonderlijk van de aggregatievraag die hier aan bod komt.

Waarom de rechte lijn van Beer-Lambert afbuigt

De wet van Beer-Lambert stelt dat de absorbantie gelijk is aan de absorptiecoëfficiënt maal de concentratie maal de weglengte. Het is een telwet. Ze veronderstelt dat de getelde objecten identiek blijven wanneer hun aantal verandert: één absorberende soort, een vast spectrum, geen concentratieafhankelijke chemie, monochromatisch meetlicht, geen verstrooiing of heremissie, en licht dat daadwerkelijk de opgegeven weg aflegt.

Aggregatie doorbreekt de eerste aanname. Formeel blijft de totale absorbantie een som over de soorten: de weglengte maal elke absorptiecoëfficiënt maal de concentratie van de bijbehorende soort. Elke soort voldoet aan de wet. Het mengsel niet, omdat de concentraties van de soorten niet-lineaire functies van de totale kleurstofconcentratie zijn. Een kalibratiecurve van de absorbantie bij de monomeerband tegen de totale kleurstofconcentratie begint daarom recht bij sterke verdunning en buigt naar beneden af wanneer de concentratie stijgt: elke extra hoeveelheid brengt verhoudingsgewijs minder monomeer met zich mee. Een curve gemeten bij de dimeerband buigt de andere kant op. Aggregatieonderzoek wijst precies dit mechanisme aan als oorzaak van de waargenomen afwijkingen van Lambert-Beer. Een rechte lijn door het gebogen gebied fitten en die extrapoleren is de gebruikelijke fout. De lijn is alleen geldig binnen het bereik en de matrix waarin ze is opgesteld.

Verdunnen creëert een verwante valkuil. Een geconcentreerde voorraadoplossing verdunnen om binnen het meetbereik van het instrument te komen, behoudt de verhouding tussen de soorten niet. In de verdunde cuvet verschuift het evenwicht naar monomeer, zodat het spectrum het verdunde monster correct beschrijft, maar de voorraadoplossing onjuist weergeeft. Het spectrum van de voorraadoplossing terugrekenen door absorbanties omhoog te schalen, levert alleen een juiste schatting van het totale gehalte op als de kalibratie al rekening houdt met die verschuiving. De oorspronkelijke bandvorm wordt er nooit door hersteld. Wie het spectrum van een concentraat met een verdunde referentie vergelijkt, vergelijkt twee verschillende mengsels.

Weglengte is onderdeel van het resultaat

De absorbantie schaalt met de afstand die het licht door het monster aflegt. Een cuvet van 10 mm geeft tien keer de absorbantie van een cuvet van 1 mm met dezelfde oplossing. Die schaling is alleen exact voor dezelfde oplossing, en door aggregatie is die voorwaarde essentieel.

In de praktijk is de weglengte een hulpmiddel om binnen het geldige bereik te blijven. Een lange weg biedt gevoeligheid voor verdunde, grotendeels monomere oplossingen. Een korte weg houdt een geconcentreerd monster binnen het meetbereik zonder een grote verdunningsstap die het evenwicht zou veranderen. Het aggregatieonderzoek achter de bovenstaande getallen paste precies dit toe: cuvetten van 1 centimeter voor 1.1 tot 34 micromolar kleurstof, en cuvetten van 0.01 centimeter voor 94 micromolar tot 3.4 millimolar. Microvolume-meetplatforms en plaatlezers voegen hun eigen geometrie toe, met korte en soms variabele weglengten en oppervlakken waaraan de kationische kleurstof kan adsorberen. Vermeld de weglengte bij de waarde, net zoals de spectrale referentie het oplosmiddel en het zout vermeldt. Een absorbantie zonder weglengte is geen resultaat. Het is een gerucht.

Uit dit mechanisme volgt een zorgvuldige meetpraktijk. Laat monsters vóór de meting op één temperatuur komen. Gebruik hetzelfde cuvettype en dezelfde oriëntatie, bijpassende blanco's met dezelfde zout- en bufferachtergrond, en schoon glaswerk. Methyleenblauw adsorbeert namelijk aan glas en kunststof, en een gekleurde cuvet draagt een herinnering aan het vorige geconcentreerde monster mee. Meet kort na bereiding wanneer de aggregatiekinetiek van belang is, en stel elke kalibratiecurve op in dezelfde matrix en met dezelfde weglengte als de onbekende monsters. Bedenk bij visuele controles dat het oog een slechte spectrometer is. Of de kleur van een oplossing zuiverheid kan aantonen is een afzonderlijke vraag waarop het antwoord nee is, en tintverschuivingen door aggregatie zijn daar één reden voor.

Een diagram om naast het instrument te houden

De onderstaande figuur vat het artikel samen in één referentie voor op de werkbank. Drie oplossingen bevatten dezelfde kleurstof, maar verschillen in totale concentratie en zoutachtergrond. Hun schematische spectra laten zien hoe de monomeerband bij lange golflengte aandeel verliest aan de dimeerband bij kortere golflengte naarmate de stapeling toeneemt. De omstandigheden staan op de figuur, omdat de curven zonder die informatie niet opnieuw kunnen worden gebruikt. Gebruik de spectrale referentie voor gemeten bandposities onder vermelde omstandigheden. Zie celopname via reductie en verdeling voor de manier waarop de kleurstof cellen binnengaat zodra ze in oplossing is. Zie lichtblootstelling en meetgeometrie voor de manier waarop lichtdosis en geometrie fotochemische meetresultaten verder beïnvloeden.

De belangrijkste regel bestaat uit twee delen. Het spectrum identificeert het mengsel dat onder de vermelde omstandigheden in de cuvet aanwezig is. Alleen een kalibratie die onder diezelfde omstandigheden is opgesteld, zet een absorbantie om in een totale concentratie.