Kan methyleenblauw mitochondriaal Complex III omzeilen? Waarom studies elkaar tegenspreken

Twee laboratoria onderzochten of methyleenblauw een geblokkeerd mitochondriaal Complex III kan omzeilen. Het ene antwoordde nee. Het andere antwoordde ja. Beide hadden gegevens.

De eerste studie, met mitochondriën uit muizenhersenen, concludeerde dat de kleurstof dat niet kan. De tweede, met hersenmitochondriën van drie knaagdiersoorten, concludeerde dat het gedeeltelijk wel kan. Een derde studie, met muizenlever, wordt vaak in dezelfde context aangehaald, maar onderzocht iets anders. Houd die op de juiste plek en de helft van de verwarring verdwijnt.

Er valt geen universeel mechanisme te verkondigen. Er zijn drie experimenten met verschillende blokkerende stoffen, doses en meetuitkomsten. Lees eerst de omstandigheden. De conclusies volgen daaruit.

Wat omzeiling hier betekent

Elektronen komen de keten binnen via Complex I (vanuit NADH) of Complex II (vanuit succinaat), gaan via Complex III naar cytochroom c en vervolgens via Complex IV naar zuurstof. De gradiënt die onderweg wordt opgebouwd, gebruikt de cel om ATP te maken.

Een bewering over omzeiling houdt in dat methyleenblauw elektronen vóór een blokkade opneemt en ze erna afgeeft. De geoxideerde kleurstof neemt elektronen op van NADH of vroege onderdelen van de keten en wordt daarbij leucomethyleenblauw. De gereduceerde vorm draagt ze over aan cytochroom c of terug aan de keten. Als die overdracht na de blokkade plaatsvindt, herstellen de respiratie en het membraanpotentiaal gedeeltelijk. Als ze op of vóór de blokkade plaatsvindt, herstelt er niets.

Eén detail van Complex III is bepalend voor een groot deel van deze discussie. Het complex doorloopt een Q-cyclus met twee bindingsplaatsen voor remmers. Antimycine bindt aan de Qi-plaats. Myxothiazol bindt aan de Qo-plaats. Een studie die maar één van beide gebruikt, heeft slechts de helft van het complex getest.

Studie één: geen omzeiling in mitochondriën uit muizenhersenen

Gureev en collega's gebruikten mitochondriën uit de hersenschors van C57BL/6-muizen, geïsoleerd met digitonine en onderzocht bij 0.1 mg eiwit per ml. De substraten omvatten drie combinaties: pyruvaat plus malaat, elk bij 5 mM, succinaat bij 10 mM met glutamaat bij 2 mM, en L-proline bij 10 mM. De blokkerende stoffen waren rotenon bij 1 micromolar (Complex I) en antimycine bij 1 microgram per ml (Complex III). De kleurstofdoses waren 0.5, 1 en 2 micromolar, met 1 micromolar als hoofdconcentratie. De methoden en meetcurven staan in de publicatie in FEBS Letters.

Omzeiling van Complex I werkte. Rotenon verlaagde de door ADP gestimuleerde respiratie van ongeveer 121 naar ongeveer 2 nmol per minuut per mg, en 1 micromolar kleurstof herstelde die tot ongeveer 21. Het membraanpotentiaal herstelde bij pyruvaat plus malaat en bij L-proline.

Omzeiling van Complex III werkte niet. Antimycine verlaagde de respiratie tot ongeveer 16, en de kleurstof verhoogde die slechts tot ongeveer 20. Het membraanpotentiaal herstelde bij geen enkel substraat, bij kleurstofdoses tot 5 micromolar. De peroxidegegevens wezen in dezelfde richting: de kleurstof alleen verhoogde de peroxideafgifte van een basale snelheid van ongeveer 76 pmol per minuut per mg naar circa 1170, 1460 en 1945 bij de drie doses. Antimycine verlaagde dat door de kleurstof aangedreven signaal echter met respectievelijk ongeveer 25, 88 en 96 procent. Als de gereduceerde kleurstof rechtstreeks met zuurstof zou reageren, zou het blokkeren van Complex III het signaal niet moeten onderdrukken. De auteurs leidden hieruit af dat de gereduceerde kleurstof wordt geoxideerd aan de Qo-plaats van Complex III, vóór de antimycineblokkade. De korte lus, in woorden: van donoren naar kleurstof, van kleurstof naar Qo, daarna verder via de normale route. Rotenon wordt omzeild. Antimycine niet.

Studie twee: gedeeltelijke omzeiling bij drie soorten, op beide remmerplaatsen

Svab en collega's breidden de onderzoeksopzet uit. Ze gebruikten hersenmitochondriën van muizen, ratten en cavia's, geïsoleerd met Percoll en onderzocht bij dezelfde 0.1 mg per ml, met pyruvaat plus malaat of glutamaat plus malaat, elk bij 5 mM. Ze gebruikten twee blokkerende stoffen voor Complex III: antimycine A bij 0.3 micromolar en myxothiazol bij 1 micromolar. De kleurstofconcentratie was 2 micromolar in de meeste metingen en 0.5 bij het onderzoek naar cytochroom c. Alle drie de soorten met op elkaar afgestemde protocollen staan in het vrij toegankelijke artikel.

Beide blokkades werden gedeeltelijk omzeild, bij alle drie de soorten. In muizenmitochondriën onderdrukte antimycine de respiratie, en de kleurstof verhoogde die met ongeveer 60 procent, van circa 37 naar 59 nmol per minuut per mg. Myxothiazol onderdrukte die met 88 procent, tot ongeveer 4.5, en de kleurstof verhoogde die vijfvoudig tot ongeveer 23. Het membraanpotentiaal repolariseerde gedeeltelijk bij beide remmers. Dit werd gemeten met twee kleurstoffen (safranine O en ratiometrische TMRM) om optische artefacten uit te sluiten.

Dit artikel testte ook rechtstreeks de overdracht, wat de eerste studie nooit deed. Exogeen geacetyleerd cytochroom c bij 25 micromolar werd niet gereduceerd door geënergiseerde mitochondriën, met of zonder remmers, maar toevoeging van de kleurstof bracht in beide gevallen reductie op gang. In celvrije buffer reduceerde NADH plus kleurstof cytochroom c met een snelheid die evenredig was met NADH. De langere sprong, in woorden: van reducerende equivalenten naar kleurstof, van kleurstof rechtstreeks naar cytochroom c, via Complex IV naar zuurstof. Die route slaat Complex III volledig over, waardoor beide blokkerende stoffen kunnen worden omzeild.

Twee extra meetuitkomsten ondersteunen die interpretatie. De NAD(P)H-fluorescentie daalde wanneer kleurstof werd toegevoegd aan met myxothiazol behandelde mitochondriën, wat betekent dat reducerende equivalenten via de nieuwe route wegstroomden. Ook volgde de absorbantie van de kleurstof bij 660 nm elke toevoeging achtereenvolgens. Gecentrifugeerde supernatanten lieten zien dat geoxideerde kleurstof zich meer dan honderdvoudig ophoopte in geënergiseerde mitochondriën en vervolgens weer naar buiten ging wanneer het potentiaal instortte. De protonenbalans past hier ook bij: door de pompstappen over te slaan, blijven er ongeveer 2 protonen per elektronenpaar over in plaats van 10. Sneller zuurstofverbruik met slechts gedeeltelijke repolarisatie is dus precies hoe een echte omzeiling eruitziet, geen bewijs ertegen.

Hetzelfde preparaat gaf reacties die zich niet oppervlakkig laten interpreteren. Met remmer plus kleurstof verlaagde ADP de respiratie in plaats van die te verhogen, en stimuleerde transportblokkade de respiratie in plaats van die te vertragen, terwijl het membraanpotentiaal nog steeds in de normale richtingen veranderde. Alleen zuurstofverbruik meten is in dit systeem misleidend.

Studie drie: de leverstudie die Complexen I en II testte, niet III

Lee en Boelsterli gebruikten mitochondriën uit muizenlever en gekweekte hepatocyten die beschadigd waren door efavirenz (Complex I, IC50 rond 30 micromolar) en hydrazine, de metaboliet van isoniazide (Complex II, IC50 rond 30 micromolar). Kleurstof bij ongeveer 30 micromolar herstelde de NADH-oxidatie, het membraanpotentiaal en ATP, terwijl oxidanten en necrotische celdood afnamen. Het artikel in Redox Biology beschrijft dit in een model waarin de kleurstof elektronen langs de beschadigde Complexen I en II vervoert.

Dat resultaat vormt vaststaande context voor eerdere stappen in de keten en zegt niets over Complex III, omdat daar niets werd geblokkeerd. Het kan geen van beide hersenstudies bevestigen of weerleggen.

De matrix van experimentele omstandigheden

Vier redenen waarom beide studies naar Complex III gelijk kunnen hebben binnen hun eigen opzet

1. De blokkerende stof vormde niet dezelfde ingreep. Alleen antimycine bij 1 microgram per ml tegenover antimycine bij 0.3 micromolar plus een afzonderlijke blokkerende stof voor de Qo-plaats. Een kleurstofroute die elektronen naar de Qo-plaats voert, faalt precies waar een rechtstreekse route naar cytochroom c slaagt. Eén plaats kan niet voor beide staan.

2. De kleurstofdosis en timing verschilden. Hoofdconcentraties van 1 tegenover 2 micromolar, bij een stof die redoxcycli doorloopt en waarvan de opname en rechtstreekse reductie van cytochroom c afhankelijk zijn van concentratie en tijd. Kleine dosisverschillen kunnen samen met verschillende meetmomenten andere trajecten van één netwerk zichtbaar maken.

3. De preparaten verschilden. Isolatie met digitonine tegenover isolatie met een Percoll-gradiënt selecteert overlappende maar niet identieke mitochondriale populaties. De eiwitconcentratie was in beide gevallen 0.1 mg per ml, dus die variabele valt weg, maar subpopulatie en integriteit niet. En de soort kon als verklaring worden uitgesloten: de tweede groep reproduceerde haar fenotype ook bij muizen.

4. De substraattoestand bepaalt wat de kleurstof kan doen. Drie substraatcombinaties tegenover NADH-gekoppelde paren. De beschikbaarheid van NADH en het membraanpotentiaal bepalen samen hoe snel de kleurstof wordt gereduceerd en waar die zich verdeelt. Een route die gereduceerde kleurstof naast geoxideerd cytochroom c nodig heeft, is afhankelijk van die keuze.

Hoe je de volgende bewering over omzeiling beoordeelt

Vraag welk complex werd geblokkeerd, met welke remmer, op welke plaats en bij welke dosis. Vraag naar de kleurstofconcentratie en het meetmoment. Vraag naar weefsel, soort, isolatiemethode, eiwitconcentratie en substraat. En vraag of potentiaal, respiratie, redoxtoestand en een directe overdrachtsmeting met elkaar overeenstemmen, want alleen zuurstofverbruik wees hier meer dan eens de verkeerde kant op.

De afgebakende samenvatting houdt stand. Over omzeiling van Complex I door de kleurstof bestaat overeenstemming. Bij Complex III laten muizenmitochondriën met antimycine bij 1 microgram per ml en kleurstof bij 1 micromolar geen functionele omzeiling zien. Drie soorten met antimycine bij 0.3 micromolar of myxothiazol bij 1 micromolar en kleurstof bij 2 micromolar laten daarentegen gedeeltelijke omzeiling zien, met rechtstreekse overdracht van de kleurstof naar cytochroom c. Die uitspraken kunnen naast elkaar bestaan. Alles wat verder gaat, is extrapolatie.

Aanvullende lectuur plaatst de omstreden bewering binnen onbetwiste chemie: hoe methyleenblauw elektronen verplaatst voor het doorgeefmechanisme, de experimenten naar omzeiling van Complex I voor het vaststaande geval eerder in de keten, metingen van het membraanpotentiaal en hun artefacten voor de reden waarom twee kleurstoffen nodig waren, en het werken met stoffen die redoxcycli doorlopen in het laboratorium voor de valkuilen bij dosering en timing.